Onderzoeksproject C3/017 (Onderzoeksactie C3)
Context
Een belangrijk domein in het microbiologisch onderzoek dat bijdraagt tot een beter begrip van het metabolisme en de biodiversiteit van micro-organismen is taxonomie. Het omvat de bepaling van hun optimale groeicondities, hun nauwkeurige identificatie en de studie en kennis van hun ecosystemen. Melkzuurbacteriën en azijnzuurbacteriën spelen wereldwijd een belangrijke rol in de productie van gefermenteerde levensmiddelen. Zij worden toegepast in talloze ambachtelijke en industriële fermentatieprocessen. Een correcte identificatie van bestaande isolaten of de isolatie van nieuwe taxa kan aanleiding geven tot een beter begrip van deze processen, een verbeterde voedselveiligheid en –kwaliteit en nieuwe, industriële toepassingen van de stammen.
Beschrijving van het Project
Doelstellingen
Dit project heeft tot doel moleculaire methoden uit te werken voor een verbeterde, genomische identificatie van melkzuurbacteriën (BCCM/LMG, Universiteit Gent) en azijnzuurbacteriën (IMDO-VUB, Vrije Universiteit Brussel) en het zal een belangrijke basis vormen voor de ontwikkeling van automatiseerbare identificatietechnieken.
Methodologieën
Als nieuwe isolatiebron van melkzuurbacteriën en azijnzuurbacteriën zullen gefermenteerde cacaobonen gebruikt worden; dit weinig gekend ecosysteem bevat tevens gisten. Natuurlijke, spontaan gefermenteerde levensmiddelen zijn een rijke bron van diverse soorten en stammen van micro-organismen met een belangrijk genetisch en metabolisch potentieel.
Heden ten dage is de soortidentificatie van melkzuurbacteriën gebaseerd op de bepaling van hun fylogenetische positie door middel van 16S rRNA-gensequentieanalyse en verdere genotypische of fenotypische vergelijking met de meest verwante soorten. Uitgebreide fenotypische databanken voor de identificatie van melkzuurbacteriën zijn gebaseerd op patronen van totaal celeiwit, verkregen door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelectroforese (SDS-PAGE). Recent werden genotypische patronen toegepast door middel van ‘Amplified Fragment Length Polymorphism’ (AFLP), hetgeen een betere differentiatie toelaat binnen bepaalde fylogenetische groepen. Het nadeel van deze ‘barcode’- of ‘fingerprintpatronen’-methoden is dat ze zeer arbeidsintensief zijn. De hoge graad van standaardisatie voor de opbouw van een continu ge-update en reproduceerbare databank laat echter geen aanpassingen noch automatisatie van de toegepaste methoden toe. Daarom en omwille van recente ontwikkelingen en aanbevelingen in de bacteriële systematiek, zal een nieuwe dimensie aan de identifcatiemethoden toegevoegd worden, namelijk de opheldering van de genomische verwantschap op inter- en intraspecies niveau door sequentieanalyse van huishoudgenen door middel van ‘MultiLocus-SequentieAnalyse’ of MLSA.
Voor de identificatie van azijnzuurbacteriën waren identificatiemethoden initieel gebaseerd op fysiologische en chemotaxonomische karakteristieken. Niettegenstaande identificatie van genera behorende tot de azijnzuurbacteriën niet zo moeilijk is, is differentiatie en identificatie van de soorten zeer problematisch. Recent worden deze fenotypische eigenschappen dan ook aangevuld met of zelfs vervangen door moleculaire technieken zoals DNA-DNA hybridisatie-experimenten, DNA-sequentieanalyse of PCR-methoden. Typeringsmethoden zoals ‘repetitive extragenic palindromic PCR’ (rep-PCR) en moleculaire methoden gebaseerd op de karakterisatie van specifieke DNA-segmenten zal evenwel de snelheid en kwaliteit van de identificatie van species van azijnzuurbacteriën aanzienlijk verbeteren. Daarnaast kan een robuust AFLP-referentiekader als alternatief voor arbeidsintensieve DNA-DNA hybridisaties dienen. Ook MLSA kan in beschouwing genomen worden, eens meer genomische informatie omtrent azijnzuurbacteriesoorten bekend wordt.
Voor de identificatie van de gisten, teneinde de biodiversiteit van gefermenteerde cacaobonen goed te kunnen beschrijven, zal beroep gedaan worden op moleculaire methoden, in vergelijking met fysiologische en morfologische profielbeschrijvingen.
Interactie tussen de verschillende partners
Isolaten van cacaoboonstalen zullen verzameld worden en melkzuurbacteriën en azijnzuurbacteriën zullen geïsoleerd en opgezuiverd worden door IMDO-VUB. IMDO-VUB en BCCM/LMG zullen instaan voor de preliminaire microbiologische testen en de bewaring van alle isolaten. Dereplicatie van de melkzuurbacterie-isolaten door middel van rep-PCR zal gebeuren door BCCM/LMG; deze van de azijnzuurbacterie-isolaten door IMDO-VUB, na uitwerking van een geschikte rep-PCR-methode. BCCM/LMG zal een MLSA-identifciatiemethode ontwikkelen voor melkzuurbacteriën. IMDO-VUB zal een identificatiemethode gebaseerd op AFLP en MLSA ontwikkelen voor azijnzuurbacteriën. Dereplicatie, bewaring en identificatie van de gisten zal gebeuren door BCCM/MUCL (subcontractant).
Verwachte resultaten en/of producten
De volgende resultaten worden verwacht:
- MLSA-databanken;
- publicaties en congresmededelingen (nieuwe taxa en biodiversiteitsstudies);
- diensten (nieuwe en bestaande representatieve stammen van diverse soorten melkzuurbacteriën en azijnzuurbacteriën zullen worden gedeponeerd en nieuwe identificatiemethoden zullen worden toegepast);
- patenten;
- opvolgprojecten;
- promoties (Master- en PhD-studenten).
Partners
Activiteiten
De interesse en expertise van BCCM/LMG gaat sinds vele jaren uit naar de taxonomie van zowel melkzuurbacteriën als azijnzuurbacteriën. Om expert in het domein te kunnen blijven, is een nieuwe benadering nodig voor een snelle identificatie van deze bacteriën. MLSA zal geëvalueerd worden en aan de basis liggen van de constructie van een referentiekader voor zowel melkzuurbacteriën als azijnzuurbacteriën.
De activiteiten van IMDO-VUB zijn gericht op de biodiversiteit (melkzuurbacteriën en azijnzuurbacteriën), populatiedynamica en metabolomica van traditionele, artisanaal gefermenteerde levensmiddelen. Dit steunt in toenemende mate op een correcte en snelle identificatie van de melkzuurbacterie- en azijnzuurbacterie-isolaten met het oog op de exploratie van nieuwe, functionele en technologische eigenschappen van interessante stammen.
Coördinaten
Promotor-coördinator:
Prof. Dr. ir. Luc De Vuyst
Onderzoeksgroep Industriële Microbiologie, Fermentatietechnologie en Downstream Processing (IMDO)
Vakgroep Bio-ingenieurswetenschappen
Vrije Universiteit Brussel
Pleinlaan 2
B-1050 Brussel
België
Tel: +32-(0)2-629 32 45
Fax: +32-(0)2-629 27 20
E-mail: ldvuyst@vub.ac.be
Website: http://www.imol.vub.ac.be/IMDO/IMDO.html
Promotor:
Prof. Dr. Paul De Vos
BCCM/LMG Bacterie Collectie
Laboratorium voor Microbiologie
Universiteit Gent
K.L. Ledeganckstraat, 35
B-9000 Gent
België
Tel: 32-(0)9-264 51 10
Fax: 32-(0)9-264 53 46
E-mail: Paul.DeVos@UGent.be
Websites: lab site: http://lmg.UGent.be and
BCCM (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms) site: http://bccm.belspo.be/
Gebruikerscomité
ing. Dirk Poelman en ir. Herwig Bernaert, Barry Callebaut N.V.
Dr. ir. Bart Degeest, Yakult Belgium N.V.
Dr. Bruno Pot, Applied Maths bvba
Dr. Paul Van Hummelen en Dr. Stefan Weckx, Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie (VIB) – MicroArray Facility (MAF)
