Projet de recherche C3/018 (Action de recherche C3)
Contexte:
Pendant les vingt dernières années, les biomolécules ont pris une position importante au sein de l’éventail des produits pharmaceutiques. La progression de ces produits a été stimulée de façon significative par le développement de lignées cellulaires et d’organismes pouvant servir d’hôtes d’expression pour la production de protéines hétérologues. Dans ce contexte, les levures et les moisissures peuvent prendre ici une position importante. Par comparaison aux cellules de mammifères, elles sont plus faciles à manipuler et elles constituent un système de production moins cher. En outre et contrairement aux organismes procaryotes comme E. coli, elles sont capables d’effectuer des modifications post-traductionnelles de protéines par l’addition de N-glycans (des glycans liés à l’asparagine). Cette dernière modification peut être particulièrement importante pour le reploiement correcte, la bio-activité et la stabilité pharmaco-cinétique de la protéine hétérologue produite ainsi que pour la stabilité temporelle résiduelle dans le sang après injection.
Description du projet:
Objectifs:
La N-glycosylation chez les levures et les moisissures est différente de celle des mammifères. Vu que l’effet des N-glycans sur la bio-activité des glycoprotéines et leurs propriétés pharmaco-cinétiques dans le sang est aussi influencé par leur structure, le but de ce projet est de générer des plasmides permettant la production, par des levures ou des moisissures, de grandes quantités de protéines hétérologues intéressantes ayant un type de N-glycosylation homogène et compatible pour leur utilisation chez l’homme et les mammifères. Cet objectif peut être divisé en plusieurs parties :
- Valorisation des plasmides de la collection BCCM/LMBP pour l’ingéniérie de la N-glycosylation.
- Production et dépôt de nouveaux plasmides, chez les levures et les moisissures, permettant la modification de la voie biosynthétique de glycosylation via un nombre minimal d’étapes.
- Analyse des N-glycans de la collection BCCM/MUCL (partenaire 2), pour l’identification de nouvelles souches de levures et de moisissures industrielles ayant des profils de N-glycosylation d’intérêt.
- Développement d’un système d’expression de protéines à la surface de la levure Pichia pastoris afin d’améliorer la sécrétion de variants protéiques (mutéines) au moyen de protéines modèles, la thrombomoduline et l’endosialine.
Méthodologie et interaction entre les différents partenaires:
- Plusieurs enzymes, importantes pour la synthèse des N-glycans chez les mammifères, doivent être exprimées dans l’organisme fongique pour obtenir la conversion des structures typiques à beaucoup de mannoses en des structures complexes comme GalGlcNAcMan5GlcNAc2. Pour réduire le nombre d’interventions génétiques et de cassettes d’expression introduites, le partenaire 1 envisage de produire des fusions entre certaines de ces enzymes de glycosylation. La levure Pichia pastoris et la moisissure Trichoderma reesei seront utilisées pour analyser l’effet de ces fusions sur la synthèse des N-glycans. Une attention particulière sera donnée à l’évaluation de plusieurs signaux de localisation d’intérêt ainsi qu’aux peptides de liaison entre les différents partenaires de la fusion protéique.
- Grâce à une technique développée au laboratoire du partenaire 1, il est maintenant possible d’effectuer un profil de N-glycans sur un échantillon biologique relativement petit. Ceci permet l’analyse d’un grand nombre de souches levures pour le profil N-glycan. Un grand nombre de souches différentes, représentant tous les groupes phylogénétiques fongiques de la collection MUCL, sera cultivé. Après leurs profiles N-glycan seront analysées et évaluées par le partenaire 1 utilisant l’électrophorèse capillaire.
- Des expériences ont établi une corrélation entre le niveau d’expression d’une protéine à la surface d’une cellule de levure et son efficacité à être sécrétée par cette même cellule. La production des domaines lectines de la thrombomoduline et de l’endosialine, deux protéines mises à la disposition du projet par le partenaire 3, est relativement faible pour les systèmes d’expression testés. Le partenaire 1 mettra ces protéines à la surface de Pichia pastoris et après mutagenèse de cet hôte, un criblage pour une souche meilleure productrice sera effectué par FACS (Fluorescent Assisted Cell Sorting). Alternativement, une bibliothèque de mutants des deux lectines pourra être exprimée à la surface de Pichia pastoris. Un criblage par FACS pourra être utilisé pour sélectionner les variants (mutéines) avec meilleure sécrétion de la protéine hétérologue. L’activité des protéines produites sera testée par le partenaire 3 au moyen de tests in vitro et in vivo.
Résultats et/ou produits attendus:
- Un souche de Pichia et de Trichoderma qui produit le N-glycan GalGlcNAcMan5GlcNAc2
homogène en un minimum d’étapes génétiques. Les protéines thérapeutiques hétérologues seront moins immunogènes pour l’homme et (après addition d’acide sialique) auront une durée de vie plus longue dans la circulation sanguine. Les souches seront aussi des outils très utiles pour la compréhension de l’effet de différentes structures N-glycan sur l’activité de la protéine à laquelle ils sont associés.
- L’analyse des N-glycans d’une grande collection fongique pourrait contribuer à une meilleure compréhension de la glycosylation fongique et produira une sous-collection d’organismes mieux caractérisés. De plus, une ou plusieurs souches ayant des propriétés intéressantes pour la production de protéines hétérologues pourraient être identifiées.
- L’hôte Pichia pour la présentation en surface de protéine sera utile pour la maturation d’affinité, la modulation des activités enzymatiques et la sélection de variants ou souches ayant une meilleure capacité de sécrétion d’une protéine donnée. Les résultats produits avec les domaines thrombomoduline et/ou endosialine, générés au sein de ce projet auront un impact important dans le développement de nouvelles thérapies pour plusieurs maladies inflammatoires ou malignes.
Partenaires:
Activités:
- Partenaire 1 (LMBP) possède une collection de 2500 plasmides caractérisés. L’institut hôte
de LMBP est, entr’autre, impliqué dans la modification du profil de N-glycosylation de
souches fongiques productrices de glycoprotéines thérapeutiques, dans l’étude du rôle de N-
glycans dans les voies de signalisation chez les eucaryotes, la bio-activité de protéines et
dans l’application de l’analyse N-glycan en tant qu’outil de diagnostic pour les maladies et le
vieillissement.
- Partenaire 2 (MBLA/BCCM/MUCL) possède une collection de plus de 28000 souches
fongiques. Le laboratoire hôte étudie les souches d’intérêts agroalimentaires et
environnementales.
- Partenaire 3 utilise des modèles animaux et la génomique fonctionnelle pour l’élucidation de
problèmes médicaux cliniques d’importance. Ils sont particulièrement intéressé dans
l’angiogenèse qui joue un rôle central dans de nombreuses maladies cardiovasculaires et
inflammatoires.
Coordonnées:
- Promoteur partenaire 1:
Prof. Dr. Roland Contreras
Unit for Fundamental and Applied Molecular Biology
Department for Molecular Biomedical Research (l'hôte du BCCM/LMBP)
Universiteit Gent et VIB
Technologiepark 927
9052 Gent-Zwijnaarde
Tel.: 09/33.13.633
Fax.: 09/33.13.502
E-mail: roland.contreras@dmbr.UGent.be
http://www.dmbr.ugent.be; http://bccm.belspo.be/about/lmbp.php
- Promoteur partenaire 2:
Prof. Dr. Anne-Marie Corbisier
Unité de Microbiologie (MBLA)
Université catholique de Louvain (l'hôte du BCCM/MUCL)
Place Croix du Sud 3
1348 Louvain-la-Neuve
Tel.: 010/47.82.61
Fax.; 010/45.15.01
E-mail: corbisier@mbla.ucl.ac.be
http://bccm.belspo.be/about/mucl.php
- Promoteur partenaire 3:
Dr. Edward Conway
Center for Transgene Technology and Gene Therapy
KU Leuven et VIB
Campus Gasthuisberg O&N
Herestraat 49
3000 Leuven
Tel.: 016/34.57.83
Fax.: 016/34.59.90
E-mail: ed.conway@med.kuleuven.ac.be
http://www.kuleuven.be/kuleuven/index.htm
Comité d’utilisateurs:
- Dr. Thierry Dauvrin, Senior Research Manager, Beldem, Andenne
- Dr. Marc Logghe, Expert Scientist bioinformatics, DevGen NV, Gent-Zwijnaarde
- Prof. Dr. Philippe Büscher, Instituut voor Tropische Geneeskunde, Antwerpen
- Dr. Geert De Jaeger, Department of Plant systems Biology, Universiteit Gent en VIB, Gent-Zwijnaarde
- Dr. Florence Xhonneux, Biologics R&D Services Manager, Eurogentec s.a., Seraing
Les membres du comité d’utilisateurs sont familiarisés avec un ou plusieurs aspects du projet.
De nouveaux développements au sein de ce projet peuvent constituer une valeur ajoutée pour leurs processus de production ou au sein de leurs propres domaines de recherches : expression de protéines hétérologues dans des souches modifiées ; identification de nouveaux systèmes d’expression ; l’utilisation du système d’expression avec présentation en surface pour l’identification d’enzymes avec des propriétés modifiées chez Pichia ; l’étude d’interactions protéines-protéines; etc.
