Onderzoeksproject C3/018 (Onderzoeksactie C3)
Context:
Gedurende de laatste 20 jaar hebben biomoleculen een belangrijke positie ingenomen binnen het spectrum van de farmaceutica. De opkomst van deze componenten werd in het bijzonder gestimuleerd door de ontwikkeling van cellijnen en organismen die kunnen dienen als gastheren voor heterologe eiwitproductie. Gisten en schimmels kunnen hier een belangrijke plaats innemen. Vergeleken met zoogdier cellijnen zijn ze makkelijker te manipuleren en vormen ze een veel goedkoper productiesysteem. Daarenboven zijn ze, in tegenstelling tot prokaryote organismen zoals E. coli, in staat om eiwitten post-translationeel te modificeren door onder andere de additie van asparagine- of N- gekoppelde glycanen. Deze laatste modificatie kan bijzonder belangrijk zijn voor de juiste opvouwing, bio-activiteit en farmaco-kinetische stabiliteit van het geproduceerde heterologe eiwit.
Beschrijving van het project:
Doelstelling:
N-glycosylatie in gisten en schimmels verschilt aanzienlijk van deze in zoogdieren. Gezien het effect van carbohydraten op de bio-activiteit en farmacokinetiek ook beïnvloed wordt door hun structuur, heeft dit project tot doel vectoren te genereren die toelaten om met behulp van gisten en schimmels interessante heterologe eiwitten in voldoende hoeveelheid en met een homogene zoogdier-compatibele N-glycosylatie te produceren. Dit doel kan opgebroken worden in verschillende onderdelen:
- Valoriseren van bestaande BCCM/LMBP plasmiden voor glycaan ‘engineering’.
- Genereren en deponeren van nieuwe vectoren die toelaten de aanpassing van de glycosylatie syntheseweg in gisten en schimmels te verrichten in een minimuum aan stappen.
- N-glycaan analyse van een grote collectie fungale organismen van de BCCM/MUCL collectie (partner 2), ter identificatie van potentiële industriële giststammen met een interessante N-glycosylatie.
- Introductie van een oppervlakte expressiesysteem in Pichia pastoris voor de selectie van beter secreterende eiwitvarianten (muteïnes) of beter producerende giststammen. Endosialine en thrombomoduline zullen hierbij gebruikt worden als modeleiwitten.
Methodologie en interactie tussen de verschillende partners:
- Verschillende enzymen, betrokken in de N-glycaan synthese bij hogere eukaryoten, moeten geïntroduceerd worden in het fungale organisme om hun typische hoog-mannose structuren te kunnen converteren naar een meer zoogdier-achtige structuur zoals GalGlcNAcMan5GlcNAc2. Om het aantal transformatiestappen en het gebruik van sterke promotoren tot een minimuum te beperken, zal partner 1 trachten fusies te genereren tussen een aantal van deze enzymen. De functionaliteit van deze fusies zal in eerste instantie uitgetest worden in de gist Pichia pastoris en de filamenteuze schimmel Trichoderma reesei. Aandacht zal besteed worden aan het uittesten van interessante localisatiesignalen en verschillende linker peptiden tussen de componenten van de fusie-eiwitten.
- Via een door partner 1 recent ontwikkelde glycaan analysetechniek is het mogelijk om op relatief weinig materiaal een N-glycaan profilering te verrichten. Hierdoor wordt analyse mogelijk van de carbohydraat struckturen van een uitgebreide collectie aan gisten. Een verzameling van verschillende stammen die alle fylogenetische groepen vertegenwoordigd binnen de MUCL collectie, zal worden opgegroeid, waarna de N-glycanen worden geanalyseerd en geëvalueerd door partner 1 via capillaire electroforese.
- Experimenten hebben een correlatie kunnen aantonen tussen de mate waarin een eiwit op het oppervlak van een gistcel geplaatst wordt en de efficiëntie waarmee het door diezelfde cel kan gesecreteerd worden. De productie van de lectine domeinen van thrombomoduline en endosialine, twee eiwitten ter beschikking gesteld door partner 3, is vrij laag in de verschillende geteste expressiesystemen. Partner 1 zal deze eiwitten op het oppervlak plaatsen van Pichia pastoris en om na mutagenese van expressiegastheer, via FACS (Fluorescent Assisted Cell Sorting) analyse te screenen naar beter producerende stammen. In een alternatieve benadering kan een mutantenbibliotheek van beide lectine domeinen op het gistoppervlak geplaatst worden. Op die manier kan met behulp van de FACS geselecteerd worden naar beter secreterende varianten (muteines) van het heterologe eiwit. De geproduceerde eiwitten zullen vervolgens door partner 3 op hun functionaliteit getest worden via in vitro en in vivo technieken.
Verwachte resultaten en/of producten:
- Een Pichia en Trichoderma stam die met een minimum aan stappen homogeen GalGlcNAcMan5GlcNAc2 kan produceren. De heterologe therapeutische eiwitten zullen minder immunogeen zijn voor de mens en (na in vitro additie van siaalzuur) ook minder vlug verwijderd worden uit de bloedbaan. Deze stammen zullen ook waardevolle hulpmiddelen zijn in de ontrafeling van het effect van verschillende glycaanstrukturen op de functionaliteit van het onderliggende eiwit.
- De N-glycaan analyse van een grote collectie aan fungi kan bijdragen tot een beter inzicht in de fungale glycosylatie en tot een subcollectie van beter gekarakteriseerde organismen en/of identificering van stammen met interessante eigenschappen voor heterologe eiwitproductie.
- Het Pichia oppervlakte expressiesysteem kan gebruikt worden voor affiniteitsmaturatie, modulering van enzymatische activiteiten en selectie van beter secreterende varianten of stammen van een specifiek eiwit. Data gegenereerd met het in dit project geproduceerde thrombomoduline of endosialine kunnen een impact hebben op de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor verschillende inflammatoire en maligne aandoeningen.
Partners:
Activiteiten:
- Partner 1 (LMBP) omvat een collectie van 2500 gekarakteriseerde plasmiden. Het gastlabo van het LMBP legt zich onder andere toe op de modificering van de N-glycosylatie op fungus-geproduceerde therapeutische glycoproteinen, op de rol van glycanen in eukaryote signaaltransductie en de bio-activiteit van eiwitten, en op het gebruik van glycaan analyse als diagnosemiddel voor ziekten en veroudering.
- Partner 2 omvat een collectie van ongeveer 28.000 gist- en schimmelstammen. Het gastlabo van deze collectie onderzoekt ondermeer het gebruik van gisten en schimmels in de voedingsindustrie, de landbouw en de milieuzorg.
- Partner 3 gebruikt diermodellen en functionele genoomanalyses voor de opheldering van klinisch relevante medische vragen. Zij richten zich vooral op de angiogenese, welke een centrale rol speelt in cardiovasculaire en inflammatoire ziekten.
Coördinaten:
- Promotor partner 1:
Prof. Dr. Roland Contreras
Unit for Fundamental and Applied Molecular Biology
Department for Molecular Biomedical Research (gastlabo BCCM/LMBP)
Universiteit Gent en VIB
Technologiepark 927
9052 Gent-Zwijnaarde
Tel.: 09/33.13.633
Fax.: 09/33.13.502
E-mail: roland.contreras@dmbr.UGent.be
http://www.dmbr.ugent.be; http://bccm.belspo.be/about/lmbp.php
- Promotor partner 2:
Prof. Dr. Anne-Marie Corbisier
Unité de Microbiologie (MBLA)
Université catholique de Louvain (gastuniversiteit BCCM/MUCL)
Place Croix du Sud 3
1348 Louvain-la-Neuve
Tel.: 010/47.82.61
Fax.; 010/45.15.01
E-mail: corbisier@mbla.ucl.ac.be
http://bccm.belspo.be/about/mucl.php
- Promotor partner 3:
Dr. Edward Conway
Center for Transgene Technology and Gene Therapy
KU Leuven en VIB
Campus Gasthuisberg O&N
Herestraat 49
3000 Leuven
Tel.: 016/34.57.83
Fax.: 016/34.59.90
E-mail: ed.conway@med.kuleuven.ac.be
http://www.kuleuven.be/kuleuven/index.htm
Gebruikerscomité
- Dr. Thierry Dauvrin, Senior Research Manager, Beldem, Andenne
- Dr. Marc Logghe, Expert Scientist bioinformatics, DevGen NV, Gent-Zwijnaarde
- Prof. Dr. Philippe Büscher, Instituut voor Tropische Geneeskunde, Antwerpen
- Dr. Geert De Jaeger, Department of Plant systems Biology, Universiteit Gent en VIB, Gent-Zwijnaarde
- Dr. Florence Xhonneux, Biologics R&D Services Manager, Eurogentec s.a., Seraing
De leden van het gebruikerscomité zijn vertrouwd met één of meerdere aspecten van het project. Nieuwe ontwikkelingen binnen het project kunnen een meerwaarde betekenen voor hun productiedoeleinden of binnen hun eigen onderzoeksdomeinen: expressie van heterologe eiwitten in gemodificeerde stammen; identificatie van nieuwe expressiesystemen; het gebruik van de Pichia oppervlakte expressie van eiwitten voor identificering van enzymen met gewijzigde eigenschappen, voor studie van eiwit-eiwit interacties,…
