Onderzoeksproject C3/019 (Onderzoeksactie C3)
Context
Aspergillus fumigatus is een wijdverspreide saprofytische schimmel uit de grond, die zowel in binnen- als buitenlucht voorkomt. A. fumigatus is de belangrijkste opportunistische pathogeen die invasieve infecties kan veroorzaken bij immunogecompromiteerde patiënten. Daarnaast is A. fumigatus ook verantwoordelijk voor kolonisaties van de luchtwegen bij mucoviscidose-patiëntenen draagt aldus bij tot een degradatie van hun longfuncties.
Het species A. fumigatus is meer pathogeen dan andere filamenteuze schimmels die in de omgeving aanwezig zijn, o.a. door zijn inherente thermotolerantie. De virulentiefactoren van A. fumigatus zijn reeds in detail bestudeerd en het staat nu vast dat virulentie in dit organisme multifactorieel is. . Daarnaast is er ook, omwille van wettelijke redenen, dringend nood aan een gestandaardiseerde en informatiseerbare moleculaire typeringsmethode die ondubbelzinnig toelaat om verwantschappen tussen klinische isolaten en omgevingsisolaten te bestuderen.
Project beschrijving
Studies die vroeger reeds uitgevoerd werden door leden van dit netwerk hebben aangetoond dat sommige genotypes van A. fumigatus frequenter voorkomen bij patiënten en dat genetische diversiteit van het species in patiënten minder belangrijk is dan in de omgeving. Dit suggereert dat, alhoewel vermoedelijk alle A. fumigatus genotypes potentieel infecties kunnen veroorzaken in gecompromiteerde patiënten, sommige isolaten meer aangepast zijn aan het leven in de gastheer, wat in principe een vijandige omgeving is voor deze schimmel.
Patiënten met invasieve aspergillosis zijn vaak simultaan besmet met diverse, genetisch, verschillende isolaten. Ook werd reeds aangetoond dat opeenvolgende isolaten (afkomstig van dezelfde patiënt maar verzameld op verschillende tijdstippen) uit longtransplantatie- patiënten tot verschillende genotypes behoren. Dit werd eveneens bevestigd bij mucoviscidose-patiënten die recent gekoloniseerd waren door A. fumigatus. Daarentegen vertonen chronisch gekoloniseerde mucoviscidose-patiënten minder genotypes; één bepaald genotype gemeenschappelijk aan alle patiënten werd aangetoond, hetgeen wijst in de richting van een genotypische selectie naargelang de vordering van de aspergillaire kolonisatie..
De “BCCM/IHEM Biomedical Fungi and Yeasts Collection” ontwikkelde reeds een belangrijke sub-collectie van A. fumigatus van diverse oorsprong en bij de start van dit project waren 1657 isolates beschikbaar, waarvan er reeds 389 gebruikt werden in publicaties.
Doelstellingen / Methodologie
Rekening houdend met de bestaande kennis op het domein van dit project, de ervaring van de partners, het biologisch materiaal en de bijhorende gegevens die beschikbaar zijn bij de BCCM/IHEM verzameling, werden de volgende doelstellingen geformuleerd voor dit project:
• Doelstelling 1
Het verder ontwikkelen van de subcollectie A. fumigatus isolaten en het verzamelen van alle relevante informatie in één databank. De BCCM/IHEM catalogus beschikbaar via http://bccm.belspo.be/db/ is gebaseerd op criteria gemeenschappelijk voor de Europese netwerk cataloog, maar is niet aangepast om ook medische en wetenschappelijke data in op te nemen.
• Doelstelling 2
Eerdere studies omtrent typering van A. fumigatus zijn sterk heterogeen en de resultaten zijn vaak moeilijk extrapoleerbaar naar andere laboratoria. Er is een dringende nood aan het ontwikkelen van een gouden standaard voor de typering van A. fumigatus. Multilocus sequence typing (MLST), in eerste instantie ontwikkeld voor bacteriën, werd recent naar voor geschoven als een krachtige en universeel-toepasbare typeringsmethode. Meer recent werd de MLST benadering ook toegepast op Candida albicans. In het projectvoorstel werd initiëel voorgesteld om een MLST schema voor A. fumigatus te ontwikkelen. Echter door de onvoorziene vertraging die dit project opgelopen heeft, werd dit deel van het werk reeds uitgevoerd door een ander team, namelijk dat van Dr. Frank Odds (Professor of Medical Mycology, Aberdeen Institute of Medical Science). Ondertussen werd echter met dit team reeds een samenwerking opgestart zodat de typering van de subcollectie snel zal kunnen starten. Dit team selecteerde 7 genen (ANX4, BGT1, CAT1, LIP, MAT1-2, SODB en ZRF2) alsook de primers voor het sequeneren. Daarnaast zullen wij ook de resultaten bekomen met MLST vergelijken met resultaten bekomen met andere methoden. De implementatie en toepassing van de MLST methode op de subcollectie is de taak van partner 2.
• Doelstelling 3
Een derde doelstelling is de identificatie van de virulentiefactoren van de dominante genotypes. Hiervoor zullen in eerste instantie de dominante genotypes bij longtransplantatie- en mucoviscidose-patiënten geïdentificeerd worden. Deze zullen dan dmv SELDI-TOF massaspectrometrie (surface enhaced laser desorption/ionisation MS) met elkaar en met minder-dominante genotypes vergeleken worden, waarbij verschillende chips arrays geselecteerd zullen worden (hydrofiel, hydrofoob, affiniteit voor metalen). De profielen zullen geanalyseerd worden met het Ciphergen systeem. 2D electrophorese kan in een later stadium gebruikt worden om interessante biomerkers verder te identificeren.
Daarnaast zullen ook de fenotypische karakteristieken betrokken in virulentie, zoals oa. adhesie van conidia, bestudeerd worden. De aanwezigheid van bepaalde receptoren aan het oppervlak van conidia zal bestudeerd worden met flow cytometrie en een aantal fysische eigenschappen zoals electrostatische lading en hydrofobiciteit van het cel-oppervlak zullen bestudeerd worden mbv microelectroforese and twee-fase partitionering.
Verwachte resultaten / producten
Een gestandaardiseerde en reproduceerbare typeringsmethode MLST zal vergeleken worden met ander beschikbare methoden en zal helpen om de epidemiologie van de kolonisatie te begrijpen in longtransplantatie- en mucoviscidosepatiënten.
De hypothese van de genotypische selectie zal geverifieerd worden, alsook de adhesiecapaciteit van de conidia. Deze gegevens zouden kunnen gebruikt worden als diagnostisch hulpmiddel en therapeutische beslissingen begeleiden in het geval van kolonisatie door A. fumigatus in CF patiënten.
SELDI zal toelaten om interessante biomerkers te karakteriseren voor diagnostische doeleinden.
De BCCM/IHEM verzameling zal een dienst ontwikkelen betreffende het toeleveren van DNA en proteïne-extracten, geproduceerd onder zeer gestandaardiseerde condities.
Interactie tussen de verschillende partners
Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid– Afdeling Mycologie (gastlaboratorium van de BCCM/IHEM Collectie) : Coordinatie van het project, bewaren van isolaten, bereiding van gestandardiseerde DNA en eiwitextracten, 2D gel electroforese
Laboratorium voor Farmaceutische Microbiologie - Ghent University : MLST typering
Laboratoire de Parasitologie Mycologie Médicale & Centre d’Investigation Clinique (Grenoble, France) : SELDI analyse, 2D gel electroforese
Laboratoire de Parasitologie Mycologie - Groupe d'Etude et d'Interaction Hôte Parasite (Angers, France) : adhesie capaciteit van conidia
Partners
Scientific Institute of Public Health- Mycology Section
Juliette Wytsmanstreet 14
B-1050 Brussels
Tel + 32 2 642 56 30
Fax +32 2 642 55 19
Dr. Françoise Symoens (f.symoens@iph.fgov.be)
Laboratorium voor Farmaceutische Microbiologie- Universiteit Gent
Harelbekestraat 72
B-9000 Gent
Tel + 32 9 264 80 91
Fax + 32 9 264 81 95
Dr. Tom Coenye (Tom.Coenye@UGent), Dr. Hans Nelis (Hans.Nelis@Ugent.be)
Laboratoire de Parasitologie Mycologie Médicale & Centre d’Investigation Clinique
CHU A Michallon, BP 217 38043 Grenoble
Tel + 33 4 76 76 54 90
Fax + 33 4 76 76 56 60
Dr. Claudine Pinel (CPinel@chu-grenoble.fr), Dr. Renée Grillot (RGrillot@chu-grenoble.fr)
Host Parasite Interaction Study Group (Groupe d’Etude des Interactions Hôte-Parasite)
Laboratoire de Parasitologie-Mycologie
4, rue Larrey F-49033 Angers Cedex 01
Tel+ 33 2 41 35 34 72
Fax + 33 2 41 35 36 16
Dr. Jean-Philippe Bouchara (Jean-Philippe.Bouchara@univ-angers.fr)
Gebruikers Committee
Dr. Lucien Noens, Department of Hematology and Bloodbank - Ghent University Hospital
Dr. Bart Gordts AZ Sint Jan AV – Brugge
Dr. Renaat Peleman - Hoofdgeneesheer UZ - Ghent - Vakgroep Inwendige ziekten
Prof. Danielle Swinne, BCCM/IHEM Collection - Scientific Institute of Public Health
