Onderzoeksproject C3/020 (Onderzoeksactie C3)
1. Context
De laatste jaren is RNA interferentie (RNAi) de uitgelezen methode geworden voor “reverse genetics” analyses in dieren en planten. In het kader van het Europese AGRIKOLA programma hebben wij bijgevolg een genoom wijde bibliotheek geconstrueerd van sekwenties en constructen voor RNAi post-transcriptionele silencing van de meeste genen in de modelplant Arabidopsis thaliana. Deze techniek is gebaseerd op de manipulatie van genomische DNA fragmenten via het Gateway recombinationele kloneringssysteem. Eerst worden genspecifieke “tags” (GST’s ) van 150 tot 500 bp geïnsereerd in “entry clones” door middel van een in vitro BP klonase reactie. Daarna worden de GST’s getransfereerd via een in vitro dubbele LR klonase reactie naar vectoren die ontworpen werden voor de expressie van “hairpin” RNA’s in transgene plantencellen. Het AGRIKOLA consortium heeft reeds meer dan 23,000 silencing constructen gegenereerd die elk de knockdown mediëren van een verschillend transcript. Het preliminaire onderzoek naar de verspreiding en frekwentie van de -fenotypes geobserveerd in Arabidopsis lijnen, getransformeerd met dergelijke constructen, toont aan dat dit een zeer waardevolle “resource” is. (Hilson et al., 2004, Genome Research 14, 2176).
2. Beschrijving van het project
2.1. Doelstellingen
Jammer genoeg laat de huidige financiering binnen het lopende Agrikola project niet toe om de bekomen constructen te valideren: hun identiteit is niet geconfirmeerd door sekwentiedata en de bacteriestammen die hen dragen zijn niet klonaal. Dit samenwerkingsproject tussen de “Functional Genomics” divisie van het Departement Plantensysteembiologie (UGent) en de BCCM/LMBP Plasmidecollectie gevestigd in de Vakgroep Moleculaire Biologie (UGent) adresseert specifiek deze tekortkomingen. Ons doel is om de kwaliteit van de AGRIKOLA resources te verhogen, de langdurige bewaring van plasmiden en bacteriestammen te verzekeren en ze te verspreiden binnen een brede onderzoeksgemeenschap onder de strikte standaarden toegepast door Biologische Resource Centra. In dit project willen we een plasmide repertoire, ontworpen voor de RNAi silencing van 2,500 Arabidopsis genen, authentiek verklaren.
2.2. Methodologie(ën)
Het voorgestelde werk kan samengevat worden in 4 opeenvolgende stappen (1) “Entry clones” die de GST’s dragen, die corresponderen met de geselecteerde genen, zullen gezuiverd worden uit de mix van AGRIKOLA bacteriële stocks. (2) Hun identiteit zal bevestigd worden door sekwentie validatie en alternatieve klones zullen herhaaldelijk geïsoleerd worden tot de juiste geauthentificeerd zijn. (3) Na transfer van de gevalideerde GST’s naar een “hairpin” RNA expressievector (deze stap is niet vervat in dit project) zal de integriteit van deze constructen bevestigd worden a.h.v. een restrictie-enzyme patroon analyse. (4) Alle authentiek bevonden plasmiden en de corresponderende Escherichia coli stammen zullen in de publieke LMBP collectie gedeponeerd worden volgens hun standaard protocols, samen met de gerelateerde data die verwerkt zullen worden binnen het BCCM bioinformatica netwerk.. Op die manier wordt de lange-termijn-bewaring van de ‘resources’ gegarandeerd, evenals hun verdeling aan derden.
2.3. Interactie tussen de verschillende partners
Het voorgestelde werk wordt uitgevoerd als een nauwe en continue samenwerking tussen PSB en LMBP, hetgeen vergemakkelijkt wordt door de locatie van beide partners in hetzelfde gebouw.
2.4. Verwachte resultaten en/of producten
Biologisch materiaal
- 2,500 zuivere Gateway “entry” klones (plasmide DNA en E. coli stam), elk geauthentificeerd a.h.v. de sekwentie-analyse van het gekloneerde GST;
- 2,500 zuivere “hairpin” RNA expressievectoren (plasmide DNA en E. coli stam), waarvan de integriteit bevestigd werd a.h.v. een restrictie-enzyme patroon analyse.
Alle plasmiden en stammen zullen door BCCM/LMBP in tweevoud worden gestockeerd en publiek beschikbaar worden gesteld.
Gerelateerde plasmide informatie
Alle relevante informatie gerelateerd aan de geauthentificeerde plasmiden zal in de BCCM/LMBP databank verwerkt worden en on line ter beschikking gesteld worden in een gestandaardiseerd formaat. Bovendien zal de BCCM/LMBP databank web interface zoekmogelijkheden voorzien om specifieke klones te vinden op basis van de naam en van de functionele annotatie van het gen dat met het GST correspondeert.
De hoog-kwalitatieve plasmidecollectie die in dit project zal gegenereerd worden zal een substantiële aanvulling vormen voor LMBP. Het zal voor de eerste keer plant-gerelateerd biologisch materiaal binnenbrengen in de BCCM. Dit zal zeker leiden tot ruime internationale belangstelling en het Arabidopsis onderzoek wereldwijd promoten.
3. Partners
3.1. Activiteiten
PSB: functionele “genomics” in planten, sekwentiebanken, “genome-scale” RNA interferentie “screens”, cel-gebaseerde assays, constructie van vectoren
LMBP: bewaring en verdeling van biologisch materiaal, plasmiden in het bijzonder, en de gerelateerde informatie
3.2. Coördinaten
Prof. Dr. Dirk Inzé and Dr. Pierre Hilson
Functional Genomics Division
Vakgroep Plantensysteembiologie
VIB – Universiteit Gent
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde
België
Tel: + 32 (0)9 33 13 830
Fax: + 32 (0)9 33 13 809
E-mail: pihil@psb.ugent.be
URL1: http://www.psb.ugent.be/
URL2: http://www.agrikola.org/
Prof. Dr. Roland Contreras and Lic. Martine Vanhoucke
BCCM/LMBP Plasmidecollectie
Vakgroep Moleculaire Biologie
Universiteit Gent
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde
België
Tel1: +32 (0)9 33 13 843
Tel2: +32 (0)9 33 13 600
Fax: +32 9 33 13 504
E-mail: bccm.lmbp@dmbr.UGent.be
URL1: http://www.dmbr.UGent.be/lmbp
URL2: http://www.belspo.be/bccm/lmbp.htm
4. Gebruikerscomité
Dr. Robert Ackerson Devgen
Prof. Geert Angenon VUB
Dr. Henri Batoko UCL
Prof. Bruno Cammue KUL
Dr. Sean May Nottingham Arabidopsis Stock Center
Dr. Michael Metzlaff Bayer CropScience
Prof. Claire Périlleux ULg
Prof. Dr. Harry Van Onckelen UA
Prof. Nathalie Verbruggen ULB
