Projet de recherche C3/022 (Action de recherche C3)
Contexte
Les ensilages constituent une part importante de l’alimentation hivernale des animaux de ferme en Belgique. Différentes récoltes, comme la plante de maïs entière, le Corn Cob Mix (CCM), l’herbe, les céréales immatures, etc, sont utilisées pour l’ensilage. C’est l’ensilage de la plante de maïs entière (produit sur 160.000 ha/an en Belgigue) qui est en majorité consommé par les bovins. L’ensilage d’herbe (recolté sur 250.000 ha/an en Belgique) représente aussi une grosse partie de l’alimentation des bœufs et des génisses laitières. (sources: http://statbel.fgov.be/downloads/crp2004_fr.xls).
En condition anaérobie, les récoltes peuvent être conservées avec succès après fermentation lactique. Cependant, la présence et le développement de moisissures dans les ensilages sont observés de manière récurrente et peuvent être à l’origine de nombreux problèmes pour l’alimentation et la santé animale. Le développement de ces moisissures dépendent de nombreux facteurs dont la contamination par des fragments de sol, un taux de sucre insuffisant, un tassement insuffisant, ….
Description du projet
Objectifs
Le projet vise à étudier la diversité biologique et métabolique des contaminants fongiques des ensilages. La caractérisation morphologique des souches fongiques isolées sera mise en relation avec la caractérisation moléculaire et complétée par des études phylogéniques afin d’enrichir la banque de données MUCL. La diversité des différentes souches fongiques isolées des différents types d'ensilage sera analysée par l'intermédiaire des profils RAPD, AFLP ainsi que des séquences ADN. Les résultats des études morphologiques, taxonomiques, phylogéniques et de diversité enrichiront la base de données de la subcollection que nous développerons au sein de la Mycothèque de l'Université catholique de Louvain (BCCMTM /MUCL). Au cours de ce projet, de nouvelles méthodes seront développées pour l’extraction et les analyses HPLC des mycotoxines isolées dans les différents ensilages. L’analyse des mycotoxines sera aussi réalisée sur des échantillons issus de culture in vitro de champignons et une attention particulière sera consacrée aux mycotoxines les moins connues et éventuellement aux métabolites inconnus d’origine fongique. L’information concernant les mycotoxines et la production de métabolites provenant des souches isolées sera utile pour affiner la caractérisation phylogénétique des souches fongiques. Des analyses toxicologiques seront réalisées sur des extraits d’échantillons d’ensilage et sur des extraits de culture fongique pure afin d'établir les dangers liés à la présence des mycotoxines mais aussi de composés fongiques toxiques peu connus ou encore inconnus. La capacité des mycotoxines pures et des extraits d'ensilages contaminés d'induire certains gènes sera évaluée à l'aide de cultures de cellules transgéniques.
Cinq partenaires (BCCM/MUCL, CERVA-CODA-VAR, Hogeschool Gent, CIPF, UA) collaborent à la réalisation de ce projet.
Méthodologie
Dans un premier temps, des exploitations agricoles pratiquant différents systèmes de culture et de production d’ensilage seront sélectionnée, afin d’obtenir une vue de la situation des ensilages de maïs et d'herbe en Belgique. Pour ce faire, des informations concernant la composition des ensilages (espèce, variété, stade phénologique de la plante au moment de la récolte) et le mode de production de ceux-ci (type de silo, moyen de tassement, etc.) seront considérés. De plus, les symptômes éventuellement développés par les animaux (maladies, problèmes de fertilité, réactions allergiques, etc.) nourris avec ces ensilages, seront enregistrés pour essayer d'établir des corrélations avec la présence de champignons, de mycotoxines et/ou de toxicité.
Dans un second temps, les ensilages sélectionnés seront analysés par des prélèvements dans les parties saines et moisies afin (1) d’isoler et identifier les moisissures, (2) d’analyser les mycotoxines présentes et (3) d’évaluer la toxicité des mycotoxines dans les ensilages.
(1) Isolement et identification des moisissures
Les moisissures seront rapidement isolées des échantillons frais par prélèvement de fractions contaminées et incubées sur milieux de culture appropriés. Les échantillons seront conservés sous huile minérale, par cryo-préservation et par lyophilisation.
En vue d’une identification précise, le séquençage des régions d’intérêt taxonomique sera basé sur l’expertise de MUCL et sur les données de la littérature. La diversité entre les espèces différentes isolées des ensilages sera étudiée en utilisant les analyses par RAPD et AFLP. Ces analyses nous permettront d’obtenir une vue d’ensemble des populations fongiques en présence.
(2) Analyse des mycotoxines
L’analyse des mycotoxines portera d’abord sur la determination des mycotoxines. « marqueurs » : le deoxynivalenol (DON) et la patuline (PAT) dans les ensilages de maïs et la PAT seule dans les ensilages d’herbe. En fonction des résultats préliminaires, d'autres mycotoxines seront analysées sur les échantillons.
(3) Toxicité des mycotoxines dans les ensilages
La toxicité des mycotoxines dans les ensilages sera évaluée sur des cellules vivantes. Au départ de la détection de la toxicité des mycotoxines, le mode d’action, la comparaison et la catégorisation des modes de contamination des différents ensilages sera déterminée. Les essais inclueront l’utilisation d’une batterie de souches bactériennes génétiquement modifiées et des lignées de cellules transgéniques de foie humain. Pour les deux approches, il s’agira d’étudier l’induction de gènes spécifiques promoteurs de stress.
Interactions entre les différents partenaires
Les partenaires CIPF et HGent collecteront les échantillons d’ensilage et l’information s’y rapportant. HGent isolera les moisissures dans les échantillons des ensilages et les enverra à MUCL pour identification. MUCL fera l’identification et cultivera les champignons dans des milieux liquides. Le CERVA analysera les mycotoxines dans les échantillons des ensilages et aussi dans les cultures liquides. L’UA utilisera les extraits pour les analyses toxicologiques. MUCL – comme coordinateur – collectera et intégrera les résultats.
Résultats et/ou produits attendus
L'étude des espèces fongiques et des mycotoxines contaminant des ensilages de maïs et d'herbe permettra de déterminer leur impact sur la qualité de ces ensilages en Belgique. L'étude permettra également d'évaluer les risques de toxicité liés à la présence des mycotoxines seules ou en combinaison. Plus spécifiquement, les retombées de ce projet de recherche sont:
- le développement de méthodes d'analyse de mycotoxines par HPLC adaptées aux matrices ensilages de maïs et ensilages d'herbe;
- un aperçu de la diversité des populations de contaminants fongiques principaux des ensilages;
- l'évaluation des effets des additifs et/ou inoculants sur la qualité des ensilages au niveau des contaminations fongiques et de la production des mycotoxines;
- la mise en place d'une base de données en ligne sur les moisissures et les mycotoxines des ensilages, servant de support aux agriculteurs pour la gestion des problèmes de contamination des ensilages en détaillant les risques de production et la toxicité des mycotoxines.
La création d'une sous-collection de souches de champignons contaminant les ensilages de maïs et d'herbe liée à l'ensemble des résultats de caractérisation fine des souches, permettra de valoriser la collection BCCMTM /MUCL. Cette caractérisation rassemblera des données morphologiques, génétiques (RAPD, AFLP, séquences), métaboliques (mycotoxines) et toxicologiques. Les associés privés auront une meilleure appréciation de la problématique de la contamination des ensilages par les moisissures et les mycotoxines produites. A terme, cela devrait permettre une amélioration de la qualité des ensilages, s et de ce fait, une réduction des frais associés à la gestion des problèmes causés par la contamination et la production des mycotoxines dans ceux-ci.
Partenaires et activités
Mycothèque de l'UCL
Coordinateur du projet. Isolement, identification (morphologique et moléculaire) des isolats. Conservation des isolats.
CERVA-CODA-VAR
Analyses des mycotoxines par HPLC, dans les ensilages et/ou dans des cultures liquides.
Hogeschool Gent, Department of Biotechnological Sciences (BIOT)
Echantillonnage des ensilages en collaboration avec le CIPF. Isolement des moisissures dans les ensilages.
Centre Indépendant de Promotion Fourragères (CIPF)
Echantillonnage des ensilages en collaboration avec Hogeschool Gent.
University of Antwerp, Department of Biology, Ecophysiology, Biochemistry and Toxicology Group
Analyses des contaminants des ensilage, en utilisant des souches bactériennes transgéniques et des cellules de foie humain.
Coordonnées
Mycothèque de l'Université catholique de Louvain (MUCL)
Unité de Microbiologie (MBLA)
Croix du Sud, 3 bte 6
B-1348 Louvain-la-Neuve, BELGIUM
Tél.: +32-10-473084
Fax : +32-10-451501
Stéphane Declerck (declerck@mbla.ucl.ac.be), François Van Hove (vanhove@mbla.ucl.ac.be), Péter Harcz (harcz@mbla.ucl.ac.be)
URL: http://www.belspo.be/bccm/
CERVA-CODA-VAR
Leuvensestenweeg 17
3080 Tervuren
Tél.:+32(2) 769 22 00
Fax:+32(2) 769 23 05
Luc Pussemier (lupus@var.fgov.be)
URL: www.var.fgov.be
Hogeschool Gent
Department of Biotechnological Sciences (BIOT)
Volkenslaan 270
B-9000 Gent
Tél.: +32(0)9 242 42 75
Fax: +32(0)9 242 42 79
Geert Haesaert (geert.haesaert@hogent.be)
URL: www.hogent.be
Centre Indépendant de Promotion Fourragères (CIPF)
Place Croix du Sud, 2 Bte 11
1348 Louvain-la-Neuve
Tél.: 010/ 47.34.62 - 010/ 47.38.40
Fax : 010/ 47.20.21
Jurgen Depoorter (j.depoorter@cipf.be)
University of Antwerp
Campus Middelheim
Department of Biology,
Ecophysiology, Biochemistry andToxicology Group
Groenenborgenlaan 171/U7
B-2020 Antwerp
Tél.: +32(0)3 265 33 47
Fax: +32(0)3 265 34 97
Ronny Blust: Ronny.Blust@ua.ac.be
Comité des utilisateurs
- M. Damien Vanoystaeyen, Agence Fédérale pour la Sécurité de la Chaîne Alimentaire (AFSCA)
- M. L. Fabry, Association Wallone de l’élevage (AWE)
- M. Ignace Dewaele, Tiense Suikerraffinaderij
- M. Guy Vandepoel, Belgische Boerenbond
- Mme Geertrui Vlaemynck, Agricultural Research Centre, Dept. of Animal Product Quality and Transformation Technology
- M. Pierre Frankinet, ALFRA sa
