Onderzoeksproject C3/022 (Onderzoeksactie C3)
Context
Kuilvoeders vormen de basis van het winterrantsoen op veebedrijven. Diverse soorten kuilvoerder zijn gangbaar: ganse plant silage van deegrijpe maïs en granen, Corn Cob Mix (CCM), graskuil, e.a. Kuilmaïs (circa 160.000 ha in België) en graskuil (circa 250.000 ha in België) zijn de twee voornaamste kuilvoeders en vormen het grootste gedeelte van het winterrantsoen op vleesvee- en melkveebedrijven (bron: http://statbel.fgov.be/downloads/crp2004_fr.xls).
Een succesvolle bewaring van ruwvoeders vereist een geslaagde fermentatie onder anaërobe omstandigheden. Hierbij dient voldoende melkzuur geproduceerd te worden. Schimmelontwikkeling in kuilen wordt echter frequent waargenomen en kan aan de basis liggen van gezondheidsproblemen met de dieren. Het voorkomen van schimmels in kuilen is afhankelijk van verschillende factoren: contaminatie van de kuil met bodemdeeltjes, onvoldoende suikers, zuurstofintrede, e.a …
Beschrijving van het project
Objectieven
Het project wil de biologische en metabolische diversiteit van fungale contaminaties in kuilen bestuderen. Hierbij wil het project de relatie maken tussen de morfologische karakterisering van de schimmel isolaten enerzijds en de moleculaire identificatie en fylogenetische aspecten anderzijds. De diversiteit van de verschillende isolaten zal onderzocht worden door gebruik te maken van RAPD, AFLP en sequentieanalyse van het DNA. De resultaten van het onderzoek op vlak van morfologie, taxonomie en fylogenie alsook van de diversiteitstudies van de geïsoleerde schimmelstammen zullen op een significante wijze de Mycotheek van de UCL aanvullen (BCCMTM/MUCL). Tevens zullen nieuwe technieken ontwikkeld worden voor de extractie en HPLC bepalingen van mycotoxinen geëxtraheerd uit de diverse kuilen. De informatie met betrekking tot mycotoxinen en de productie van metabolieten afkomstig van opgezuiverde stammen is nodig om de schimmelstammen fylogenetisch te kunnen karakteriseren. De analysen m.b.t. toxische componenten zullen worden uitgevoerd op extracten afkomstig van kuilmonsters en van zuivere schimmelculturen dit om op het gevaar van de aanwezigheid van mycotoxinen te wijzen maar tevens ook om de aanwezigheid van minder gekende en zelfs ongekende toxische componenten aan te kunnen tonen. De interactie van de mycotoxinen aanwezig in de gecontamineerde kuilen en de zuivere culturen zal bestudeerd worden met bepaalde stressgenen d.m.v. getransformeerde celculturen.
Vijf partners (BCCM/MUCL, CERVA-CODA-VAR, Hogeschool Gent, CIPF, UA) werken samen om de doelstellingen van het project te realiseren.
Methodologie
In het eerste gedeelte van het project, zullen diverse landbouwbedrijven worden uitgezocht op basis van verschillen in gewasuitbating en inkuiltechniek. Dit moet een goed beeld opleveren omtrent de inkuilmethodiek van grassen en maïs op praktijkniveau in België. Gegevens i.v.m. het uitgangsproduct (soort, ras, fenologisch stadium bij oogst, e.a.), kuiltype, aandrukwijze, … zullen worden verzameld. Tevens zal informatie vergaard worden omtrent de gezondheidstoestand van de dieren (ziekten, problemen met fertiliteit, allergische reacties, e.a.) die in relatie kan gebracht met het kuilvoeder en de eventuele aanwezigheid van schimmels en hun mycotoxinen.
Van de bemonsterde kuilen zullen zowel de gezonde als de visueel met schimmel aangetaste kuildelen onderzocht worden teneinde (1) de aanwezige schimmels te isoleren en te typeren, (2) de mycotoxinen te analyseren en (3) de toxiciteit van de gevonden mycotoxinen te bepalen.
(1) isolatie en identificatie van de schimmels
De schimmelsoorten worden zo snel als mogelijk geïsoleerd vanuit de gekoelde monsters (bewaard bij 4°C) door gecontamineerde kuildeeltjes te incuberen op aangepast voedingsmedium. Na isolatie worden de culturen toegevoegd aan de Mycotheek van de UCL (BCCMTM/MUCL) en geconserveerd onder minerale olie, door cryoconservatie of/en door lyofilisatie. De genetische diversiteit van de bekomen isolaten zal bestudeerd worden door gebruik te maken van RAPD en AFLP technieken. Dit moet toelaten ons een beeld te vormen van de intraspecifieke variatie binnen de gevonden schimmelsoorten.
(2) Analyse van de mycotoxinen
In eerste instantie zullen de analysen zich richten naar de detectie van enkele referentie mycotoxinen zoals het deoxynivalenol (DON) in maïskuilen en op PAT in graskuilen. Op basis van de eerste resultaten zullen monster die gecontamineerd zijn met DON en/of PAT verder onderzocht worden op gerelateerde mycotoxinen.
(3)Toxiciteit van kuilextracten
De toxiciteit van kuilextracten afkomstig van gecontamineerde kuilzones zal worden nagegaan met behulp van getransformeerde celculturen. Deze methodiek laat toe de wijze van metabolische interactie van de toxische componenten aanwezig in gecontamineerde kuilen te bestuderen en te vergelijken. Dank zij het inschakelen van deze celculturen kunnen meer complexe effecten ( synergie, additiviteit, e.a.) bestudeerd worden. De testen zijn gebaseerd op genetisch getransformeerde bacteriecellen en humane levercellen. In beide scenario’s wordt gebruik gemaakt van specifieke stressgenen.
Samenwerking tussen de verschillende partners
Het CIPF en de Hogeschool Gent, departement Biowetenschappen, staan in voor het bemonsteren van de kuilen en het verzamelen van de randinformatie. De isolatie van de diverse schimmels gebeurt door de Hogeschool Gent; na isolatie worden de culturen naar het MUCL gestuurd voor verdere identificatie en opkweek. Het CODA staat in voor de chemische analyse van de mycotoxinen aanwezig in extracten van kuilvoeder of in de zuivere opgekweekte culturen. UA vormt de toxiciteitstesten uit op basis van celculturen. Het MUCL is coördinator van het project en staat dus in voor de rapportering en samenvatting van de resultaten.
Verwachte resultaten
De studie van de mycoflora en geassocieerde mycotoxinen die voorkomen in maïs- en graskuilen laat toe hun impact op de kwaliteit van kuilvoeder in België vast te leggen. De studie laat tevens toe de risico’s te analyseren die gekoppeld zijn aan de aanwezigheid van mycotoxinen of van een combinatie van mycotoxinen. Meer specifiek kan gesteld worden dat het project zal bijdragen tot:
- de ontwikkeling van HPLC analysemethoden voor mycotoxinen in een matrix afkomstig van maïs- en graskuilen;
- een overzicht geven van de diversiteit van de voornaamste schimmelpopulaties aanwezig in kuilen;
- evaluatie van de effecten van kuiladditieven (chemisch en inoculanten) op de schimmelcontaminatie en de productie van mycotoxinen;
- informatie ter beschikking stellen aan landbouwers in verband met schimmelsoorten en mycotoxinen die voorkomen in kuilen zodanig dat ze het probleem van door schimmel gecontamineerde kuilen beter kunnen beheersen en de productie van mycotoxinen kunnen verminderen.
Het creëren van een specifieke deelcollectie door het verzamelen en bewaren van schimmelspecies en –stammen afkomstig uit gecontamineerde gras- en maïskuilen maakt in combinatie met de verkregen resultaten die een gedetailleerde karakterisering toelaten van de verkregen isolaten, een optimale valorisatie mogelijk van de BCCMTM/MUCL collectie. Deze karakterisering stelt gegevens ter beschikking omtrent morfologische, genetische (RAPD, AFLP, sequenties ), metabolische (mycotoxinen) en toxicologische karakteristieken van de isolaten.
De leden van de gebruikerscommissie verkrijgen via de projectresultaten een beter inzicht in de problematiek van kuilcontaminatie door schimmels en hun mycotoxinen. Dit moet toelaten tot een betere beheersing te komen van kuilschimmels en tot de uitschakeling van de nadelige gevolgen daarvan.
De verschillende partners en hun activiteiten
Mycotheek UCL
Coördinator van het project. Isolatie en identificatie (morfologisch en moleculaire) van de isolaten. Conservatie van de isolaten.
CERVA-CODA-VAR
Analyse van de mycotoxinen met behulp van HPLC; de analysen zullen uitgevoerd worden op extracten van gecontamineerde kuildelen of van zuivere culturen.
Hogeschool Gent, departement Biowetenschappen
Monstername in samenwerking met het CIPF. Isolatie van schimmels uit de gecontamineerde kuilen; voorbereiding van de isolaten.
CIPF
Bemonstering van gecontamineerde kuilen.
Universiteit Antwerpen, departement voor Biologie, Ecofysiologie, Biochemie en toxicologie
Toxiciteitstesten met behulp van genetisch getransformeerde celculturen.
Coördinaten
Mycothèque de l'Université catholique de Louvain (MUCL)
Unité de Microbiologie (MBLA)
Croix du Sud, 3 bte 6
B-1348 Louvain-la-Neuve, BELGIUM
Tel : +32-10-473084
Fax : +32-10-451501
Stéphane DeClerck (declerck@mbla.ucl.ac.be), François Van Hove (vanhove@mbla.ucl.ac.be), Péter Harcz (harcz@mbla.ucl.ac.be)
URL: http://www.belspo.be/bccm/
CERVA-CODA-VAR
Leuvensestenweeg 17
3080 Tervuren
Tel:+32(2) 769 22 00
Fax:+32(2) 769 23 05
Luc Pussemier (lupus@var.fgov.be)
URL: www.var.fgov.be
Hogeschool Gent
Department of Biotechnological Sciences (BIOT)
Volkenslaan 270
B-9000 Gent
Tel : +32(0)9 242 42 75
Fax: +32(0)9 242 42 79
Geert Haesaert (geert.haesaert@hogent.be)
URL: www.hogent.be
Centre Indépendant de Promotion Fourragères (CIPF)
Place Croix du Sud, 2 Bte 11
1348 Louvain-la-Neuve
Tel : 010/ 47.34.62 - 010/ 47.38.40
Fax : 010/ 47.20.21
Guy Foucart (foucart@ecop.ucl.ac.be)
University of Antwerp
Campus Middelheim
Department of Biology,
Ecophysiology, Biochemistry andToxicology Group
Groenenborgenlaan 171/U7
B-2020 Antwerp
Tel: +32(0)3 265 33 47
Fax: +32(0)3 265 34 97
Ronny Blust: Ronny.Blust@ua.ac.be
Gebruikerscommissie
- M. Damien Vanoystaeyen, Agence Fédérale pour la Sécurité de la Chaîne Alimentaire (AFSCA)
- M. L. Fabry, Association Wallone de l’élevage (AWE)
- M. Ignace Dewaele, Tiense Suikerraffinaderij
- M. Guy Vandepoel, Belgische Boerenbond
- Mme Geertrui Vlaemynck, Agricultural Research Centre, Dept. of Animal Product Quality and Transformation Technology
- M. Pierre Frankinet, ALFRA sa
