Projet de recherche NO/B/002 (Action de recherche NO)
Contexte
Salmonella et Listeria monocytogenes sont des pathogènes importants dans l'alimentation. La législation belge oblige la recherche de Salmonella et L. monocytogenes dans les produits laitiers et de Salmonella dans la viande hachée congelée; plusieurs pays importateurs exigent l'absence de ces pathogènes. Les méthodes standards pour la détection demandent du temps. Des nouvelles méthodes, rapides peuvent offrir une solution.
Le projet
Dans le projet, des méthodes rapides de détection ont été développées pour Salmonella spp. et L. monocytogenes dans les produits laitiers et de viande. Ces méthodes atteignent la même sensibilité et spécificité que les méthodes conventionnelles. Pour cela, on utilise des technologies récentes, comme la séparation immuno-magnétique et la PCR. Certaines étapes des méthodes de détection conventionnelles ont été raccourcies. Par ailleurs, on a apporté attention à la possibilité d'enrichir les deux pathogènes dans un seul et même milieu. L'effet du ‘pooling’ des échantillons sur l'efficience des méthodes a été étudié.
Parce que les échantillons alimentaires, naturellement contaminés avec Salmonella et L. monocytogenes n'étaient pas suffisamment disponibles, la recherche a été effectuée en grande partie grâce à une contamination artificielle avec des cellules stressées (RIVM, Nederland).
Le protocole Salmonella pour le jaune d’oeuf pasteurisé, la poudre de jaune d’oeuf, la glace et le fromage à base de lait pasteurisé se compose d'un enrichissement de 16 h dans un milieu d'eau tamponné peptone (BPW) suivi par une PCR ). La séparation immuno-magnétique (IMS) et une méthode de lyse alcaline sont utilisées comme préparation d'échantillon. Pour la poudre de lait, l’oeuf complet, le blanc d’oeuf et le fromage de lait cru, l'enrichissement de 16 h dans le BPW est suivi d'une IMS et d'un enrichissement sélectif de 4 h dans un milieu Rappaport-Vassiliadis (RV). Dans ce cas, la PCR est appliquée sur la culture d'enrichissement sélectif après centrifugation et lyse alcaline. Pour l’oeuf complet et le blanc d’oeuf, on ajoute au BPW 20 µg de citrate d'ammonium de fer ou de chlorure de fer /ml .
Le protocole Salmonella pour la viande et les produits de viande comporte un enrichissement dans le BPW pendant 16 h, une filtration et une centrifugation de 1,5 ml de culture, une lyse alcaline du dépôt et une PCR (35 cycles) sur 1 µl du lysat.
Le pooling pour la détection de Salmonella dans les produits laitiers est possible pour la poudre de lait, le fromage Gouda et le produit d’oeuf, aussi bien via la méthode de PCR rapide que via la méthode conventionnelle. Pour la crème glace et les fromages à base de lait cru, le pooling n'est pas à conseiller. Le pooling des échantillons pour la détection de Salmonella stressées dans la viande et les produits de viande est possible avec la méthode de culture, mais pas avec la méthode de PCR développée.
Pour la PCR de Salmonella , des primers ST11 et ST15 (Aabo et al., Mol. Cell. Probes, 7: 171-178) ont été utilisés. Via ces primers, un fragment de 429 bp est amplifié. Un contrôle de PCR interne a été développé, qui est multiplié au moyen des mêmes primers ST11 en ST15 mais qui résulte dans l'amplification d'un fragment plus petit de 240 bp. Cet ADN de contrôle peut être multiplié avec la cible en une réaction ou utilisé comme réaction séparément. Il semble, à partir de nos résultats, que la multiplication commune de l'ADN de contrôle et la cible peut travailler parfaitement sur de l'ADN pur mais que le système peut être déstabilisé lorsqu'il est appliqué sur certains échantillons d'aliment
Les résultats concernant la détection rapide de Salmonella sont décrits dans Rijpens et al. (1999, Int. J. Food Microbiol. 46, 37-44).
a détection via PCR sur la culture enrichie de L. monocytogenes donne une sensibilité satisfaisante, comparable avec la sensibilité obtenue avec la méthode standard. Il n'est pas possible d'encore raccourcir l'enrichissement liquide de la méthode conventionnelle (2 jours). Le gain de temps est obtenu en remplaçant la culture sur milieu sélectif par une PCR. On obtient ainsi une méthode de deux jours au total.
Il faut cependant remarquer qu'aucun des protocoles d'enrichissement liquide testés, qui sont aussi utilisés dans les procédures conventionnelles, ne sont capables de détecter de petites quantités de cellules stressées de L. monocytogenes dans le fromage de lait cru et la viande fraîche. Vu la lente croissance de L. monocytogenes, il n'était pas nécessaire d'effectuer de recherche pour le pooling d'échantillons.
Parce que les L. monocytogenes stressées croissent très lentement en présence de produit alimentaire (composants alimentaires et flore environnante), les quantités qui sont atteintes après 16 ou 20 h de pré-enrichissement ne suffisent pas pour permettre une détection PCR. Par conséquent, il n'est donc pas possible de détecter simultanément et de manière efficiente Salmonella et L. monocytogenes.
Les partenaires
Departement voor Kwaliteit van Dierlijke Producten: développement d'une méthode de détection pour les produits laitiers.
Universiteit Gent, facult. Diergeneeskunde: développement d'une méthode de détection pour la viande et les produits de viande.
Partenaires- conseils: Micro-Smedt, Jef De Smedt en NV Innogenetics S.A., Rudi Rossau, Geert Jannes.
Produits et résultats attendus
La recherche a développé une méthode rapide pour la détection de L. monocytogenes et Salmonella et de plus, elle a formulé des recommandations pour la validation de méthodes rapides. Cette validation doit tenir compte des points suivants :
1. Il est nécessaire de valider des méthodes de détection rapides des pathogènes sur un large éventail de produits alimentaires avec différentes flores environnantes.
2. Les cellules stressées de Salmonella sont un instrument utilisable pour valider des méthodes rapides pour les denrées alimentaires avec un taux de contamination naturel bas. Pour certaines denrées alimentaires avec une flore environnante complexe, il est conseillé une validation sur les échantillons contaminés naturellement.
3. L'utilisation de cellules stressées de L. monocytogenes a montré les limites de toutes les méthodes couramment utilisées, y compris la méthode standard conventionnelle.
4. Il faut être prudent avec les méthodes PCR lorsque plus de 35 cycles de température sont appliqués.
Ontwikkeling van een ééndagsmethode voor het opsporen van Listeria monocytogenes en Salmonella : eindverslag
Brussel : Federaal Wetenschapsbeleid, 2003 (SP1162)
[Pour télécharger]
