Onderzoeksproject NO/B/002 (Onderzoeksactie NO)
Context
Salmonella en Listeria monocytogenes zijn belangrijke voedselpathogenen. De Belgische wetgeving verplicht het onderzoek van Salmonella en Listeria monocytogenes in zuivelproducten en van Salmonella in diepgevroren gehaktvlees; diverse importerende landen eisen afwezigheid van deze pathogenen. De standaardmethodes voor detectie zijn tijdrovend. Nieuwe, snelle methodes kunnen een uitkomst bieden.
Het project
In het project werden snelle detectiemethodes voor Salmonella spp. en Listeria monocytogenes in zuivel- en vleesproducten ontwikkeld. Deze methodes bereiken dezelfde gevoeligheid en specificiteit als de conventionele methodes. Hiertoe wordt gebruik gemaakt van recente technologieën, zoals immunomagnetische scheiding en PCR. Een aantal stappen in de conventionele detectiemethodes werden verkort. Tevens werd aandacht besteed aan de mogelijkheid om beide pathogenen in éénzelfde medium aan te rijken. Het effect van ‘pooling’ van monsters op de efficiëntie van de methoden werd onderzocht.
Omdat voedingsstalen, natuurlijk besmet met Salmonella en Listeria monocytogenes onvoldoende voor handen waren, werd het onderzoek voor een groot deel uitgevoerd d.m.v. kunstmatige besmetting met gestresseerde cellen (RIVM, Nederland).
Het Salmonellaprotocol voor gepasteuriseerd eigeel, eigeelpoeder, ijs, en kaas op basis van gepasteuriseerde melk bestaat uit 16 u aanrijking in gebufferd peptone water (BPW) gevolgd door PCR . Immunomagnetische scheiding (IMS) en een alkalische lysemethode worden gebruikt als staalvoorbereiding. Voor melkpoeder, volledig ei, eiwit en rauwmelkse kaas wordt de 16 u aanrijking in BPW gevolgd door IMS en een selectieve aanrijking in Rappaport-Vassiliadis (RV) medium voor 4 u. In dit geval wordt PCR toegepast op de selectieve aanrijkingscultuur na centrifugatie en alkalische lyse. Voor volledig ei en eiwit wordt aan het BPW 20 µg ijzer ammonium citraat of ijzer chloride /ml toegediend.
Het Salmonella protocol voor vlees en vleesproducten omvat een aanrijking in BPW gedurende 16 u, filtratie en centrifugatie van de 1,5 ml cultuur, alkalische lyse van de neerslag en PCR (35 cycli) op 1 µl van het lysaat.
Pooling voor de detectie van Salmonella in zuivelproducten is mogelijk voor melkpoeder, Goudse kaas en eiproduct, zowel via de snelle PCR-methode als via de conventionele methode. Voor roomijs en kazen op basis van rauwe melk is pooling niet aan te raden. Het poolen van monsters voor het opsporen van gestresseerde Salmonella in vlees en vleesproducten is mogelijk met de cultuurmethode, echter niet met de ontwikkelde PCR-methode.
Voor de Salmonella PCR werden de primers ST11 en ST15 (Aabo et al., Mol. Cell. Probes, 7: 171-178) gebruikt. Via deze primers wordt een fragment van 429 bp geamplifieerd. Een interne PCR controle werd ontwikkeld die vermenigvuldigd wordt door middel van dezelfde ST11 en ST15 primers maar resulteert in de amplificatie van een kleiner fragment van 240 bp. Dit controle-DNA kan samen met het doelwit in 1 reactie worden vermenigvuldigd of als afzonderlijke reactie worden ingezet. Uit onze resultaten is gebleken dat het gemeenschappelijk vermenigvuldigen van controle DNA en doelwit perfect kan werken op zuiver DNA, maar dat het systeem uit balans kan geraken als het wordt toegepast op sommige voedingsmonsters
De resultaten i.v.m. de snelle detectie van Salmonella zijn beschreven in Rijpens et al. (1999, Int. J. Food Microbiol. 46, 37-44).
De detectie via PCR op de aanrijkingscultuur van Listeria monocytogenes geeft een bevredigende gevoeligheid, vergelijkbaar met de gevoeligheid verkregen via de standaardmethode. Het is niet mogelijk om de vloeibare aanrijking van de conventionele methode (2 dagen) nog verder te verkorten. De tijdswinst wordt bekomen door de cultuur op selectieve bodem te vervangen door een PCR. Zo bekomt men een methode van 2 dagen in totaal.
Het dient echter opgemerkt dat geen enkele van de uitgeteste vloeibare aanrijkingsprotocols die ook in de conventionele procedures worden gebruikt in staat is om kleine aantallen gestresseerde Listeria monocytogenes-cellen op te sporen in rauwmelkse kaas en vers vlees.
Omwille van de trage groei van Listeria monocytogenes was het niet nuttig om onderzoek uit te voeren naar de pooling van monsters.
Omdat gestresseerde Listeria monocytogenes zeer traag groeien in aanwezigheid van voedingsmiddel (voedingscomponenten én nevenflora) volstaan de aantallen die bereikt worden na 16 of 20 uur vooraanrijking niet om PCR-detectie toe te laten. Het is bijgevolg niet mogelijk om simultaan op een efficiënte wijze Salmonella en Listeria monocytogenes op te sporen.
De partners
Departement voor Kwaliteit van Dierlijke Producten: ontwikkelen detectiemethode voor zuivelproducten.
Universiteit Gent, facult. Diergeneeskunde: ontwikkelen detectiemethode voor vlees en vleesproducten
Adviserende partners: Micro-Smedt, Jef De Smedt en NV Innogenetics S.A., Rudi Rossau, Geert Jannes
Verwachte eind-bijproducten en resultaten
Het onderzoek heeft een snelle methode ontwikkeld voor de detectie van Salmonella en Listeria monocytogenes en tevens aanbevelingen geformuleerd voor de validatie van snelle methodes. Deze validatie dient rekening te houden met het volgende:
1. Het is noodzakelijk om snelle detectiemethodes voor pathogenen te valideren op een brede waaier aan voedingsproducten met verschillende achtergrondflora
2. Gestresseerde Salmonella-cellen zijn een bruikbaar instrument om snelle methodes te valideren voor voedingsmiddelen met een lage natuurlijke besmettingsgraad. Voor bepaalde voedingsmiddelen met een complexe achtergrondflora is een validatie op natuurlijk besmette monsters aan te raden.
3. Het gebruik van gestresseerde Listeria monocytogenes-cellen heeft de beperkingen aangetoond van alle gangbare methodes, inclusief de conventionele standaardmethode.
4. Men dient voorzichtig om te springen met PCR-methodes waar meer dan 35 temperatuurcycli worden toegepast.
Ontwikkeling van een ééndagsmethode voor het opsporen van Listeria monocytogenes en Salmonella : eindverslag
Brussel : Federaal Wetenschapsbeleid, 2003 (SP1162)
[Om te downloaden]
