Projet de recherche P5/05 (Action de recherche P5)
Les huit partenaires de ce réseau collaborent sur trois processus majeurs et interconnectés qui contrôlent de fait chaque fonction des cellules eucaryotes:
(1) le transport transmembranire d'ions, d'eau et de solutés;
(2) la dynamique du Ca2+ comme messager secondaire; et
(3) la phosphorylation de protéines comme aboutissement de la transduction du signal.
1. Transport à travers la membrane plasmique - Deux cibles sont proposés pour une étude conjointe:
1.1. Les ATPases-H+ de plantes subissent une phosphorylation réversible qui induit une activation grâce à la liaison de protéines de régulation de type 14-3-3. Le site de phosphorylation est particulier et incite donc une recherche des kinases et phosphatases impliquées. En parallèle, on recherchera si l'expression et la phosphorylation des ATPases-H+ varient en fonction du stade de développement et des stress environnementaux.
1.2. Les aquaporines sont des canaux à eau. Cependant, certaines isoformes d'espèces animales ou végétales transportent d'autres molécules qui seront identifiées en collaboration. Certaines aquaporines sont phosphorylées. Le mode de phosphorylation et les conséquences fonctionnelles seront recherchées.
2. La signalisation du Ca2+ fait intervenir son influx, son relâchement et sa reprise:
2.1. L'entrée du Ca2+ par les canaux TRP fera l'objet d'une étude majeure par plusieurs partenaires: la modulation de l'activité des canaux par phosphorylation ainsi que par les sphingolipides, le PUFA et ses dérivés; l'identification de protéines interagissant avec les TRP; l'interaction des TRP avec le cytosquelette dans l'assemblage de complexes de signalisation.
2.2. Le Ca2+ contrôle le relâchement du Ca2+ via le récepteur de l'IP3 (IP3R). Des kinases et/ou des phophatases dépendant du Ca2+ ou de la calmoduline peuvent y jouer un rôle important. Leur rôle exact, leur mode d'interaction précis avec l'IP3R et le(s) site(s) de phosphorylation seront déterminés.
2.3. Les deux groupes centrés sur le phospho-inositol vont élargir leur études par la surexpression d'enzymes du métabolisme de l'IP3 afin d'étudier la dynamique de la voie de signalisation intracellulaire du Ca2+. Ils appliqueront également cette technique afin, d'une part, de suivre la propagation d'ondes de Ca2+ entre cellules (dans des types cellulaires utilisant des modes de communication distincts) et, d'autre part, d'étudier la dynamique du Ca2+ dans des compartiments subcellulaires.
2.4. Le rôle de l'appareil de Golgi dans l'élaboration de signaux intracellulaires de Ca2+ sera analysé par diverses approches: l'importance du PIP2 sera étudiée par la surexpression d'une 5-phosphatase spécifique; en outre, une pompe à Ca2+ dépendant de l'ATP découverte récemment sera la cible d'études fonctionnelles et moléculaires; de plus, le rôle de sphingolipides dans le relâchement du Ca2+ par des mécanismes indépendants de l'IP3 sera exploré.
2.5. Les rôles spécifiques des ATPases-Ca2+ du réticulum sarco(endo)plasmique SERCA2b et SERCA2a (cette dernière avec le phospholamban, son régulateur phosphorylable) seront déterminés en tirant parti d'une souris transgénique qui exprime uniquement SERCA2b dans le réticulum sarcoplasmique. En outre, la raison pour laquelle le niveau de phosphorylation du phospholamban est élevé durant la période postnatale précoce sera investiguée.
3. Contrôle de fonctions cellulaires par la phosphorylation de protéines:
3.1. Modulation de la signalisation de l'insuline dans des voies métaboliques: plusieurs partenaires collaboreront afin de purifier, cloner et caractériser la protéine kinase WISK découverte récemment, de préciser le rôle de la PKB et d'étudier l'interférence par SHIP2. Une autre cible sera le métabolisme du méthylglyoxal qui pourrait être impliqué dans la génération d'AGEs qui contribuent à la pathogenèse de complications diabétiques.
3.2. Identification de substrats physiologiques de protéine phosphatases: à cette fin, des cellules seront transfectées de manière stable avec des vecteurs d'expression pour des domaines polypeptidiques inhibiteurs se liant fortement à PP1 ou PP2A et fusionnés à des séquences d'adressage de différents compartiments subcellulaires.
3.3. Phopholipides et contrôle de l'organisation du cytosquelette: une collaboration visera à caractériser la (les) phosphatase(s) catalysant la déphosphorylation stimulée par le lysophosphatidate de l'actine phosphorylée par l'AFK; un second projet se focalisera sur le rôle émergeant du lysophosphatidate comme médiateur cellulaire général, par exemple, en utilisant le dérivé fluorescent synthétisé récemment.
