Projet de recherche P5/30 (Action de recherche P5)
Le coordinateur et les cinq partenaires associés occupent une position forte dans le domaine de recherche de la transduction des signaux biologiques. Le but de la présente demande est d’obtenir un soutien supplémentaire permettant de renforcer leurs programmes de recherche individuels en conjuguant leurs efforts centrés sur l’étude des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) appartenant à la sous-famille de la rhodopsine. L’expertise combinée des différents partenaires couvre l’entièreté du spectre des méthodes et des concepts requis pour une étude efficace des RCPGs : en particulier, la génomique fonctionnelle et comparée, la protéomique y compris l’accès aux équipements les plus modernes de spectrométrie de masse, la pharmacologie moléculaire, les études de relations structure-fonction, la modélisation moléculaire, la transgénèse murine. Deux des partenaires apportent une expertise supplémentaire, respectivement dans les domaines de la transduction des signaux chez la levure et en virologie moléculaire, ce qui pourra conduire à de nouveaux développements méthodologiques.
Le programme sera subdivisé en six « workpackages » (le coordinateur et les partenaires sont identifiés dans le texte respectivement par P1 et P2 à P6 ; le partenaire européen est identifié par P7).
WP1: Génomique fonctionnelle et pharmacologie inverse des RCPGs.
Cette partie du projet traitera de la caractérisation de RCPGs orphelins et de l’identification de leurs agonistes naturels. Elle se concentrera sur des sous-types de récepteurs que leur similitudes de séquences apparentent à des récepteurs pour lesquels les les partenaires disposent d’une substantielle expérience : les récepteurs des chimiokines (P1, P5), des récepteurs de neuropeptides, tant de vertébrés que d’invertébrés (P1, P2), des récepteurs apparentés aux récepteurs de l’angiotensine (P1, P6), des récepteurs de vertébrés et d’invertébrés, apparentés aux recepteurs de hormones glycoprotéiques (P1, P2) et, enfin, des récepteurs de vertébrés et d’invertébrés qui pourraient être apparentés au récepteur du glucose et du saccharose, chez la levure (P4, P2, P1). Ces études comprendront le criblage systématique de sources naturelles (extraits tissulaires, fluides corporels naturels, exsudats inflammatoires...) ou synthétiques (collections de ligands potentiels, peptides syntétiques, bibliothèques de composés....) à la recherche d‘activités biologiques détectables au moyen de cellules transfectées qui expriment de manière stable les récepteurs d’intérêt. Ces cellules, dont une série est disponible, ont été établies de telle sorte que leur stimuilation en gendre un signal détectable, quelle que soit la cascade de régulation activée par le récepteur. La distribution tissulaire des récepteurs soumis à ce type d’étude sera explorée par immunohistochimie et par hybridation in situ.
WP2: Pharmacologie moléculaire et relations structure-fonction de RCPGs connus.
Les étapes et les acteurs moléculaires impliqués dans les effets d’agonistes, d’agonistes inverses et d’antagonistes seront étudiés sur une série de récepteurs par une combinaison d’études de liaison, et d’activation fonctionnelle de récepteurs exprimés par des cellules transfectées, ainsi que par modélisation moléculaire (P7) et mutagénèse dirigée. Les récepteurs sélectionnés pour ce type d’études seront ceux pour lesquels il existe chez les partenaires un intérêt de longue date : les récepteurs aux hormones glycoprotéiques et leurs homologues d’invertébrés (P1, P2) ; les récepteurs au tachykinines d’insectes (P2) ; les récepteurs aux chimiokines (P1, P5) ; les récepteurs de l’angiotensine et de dérivés pourvu d’activité physiologique (P6) ; le récepteur au saccharose et au glucose de la levure (P4).
WP3: Etude du rôle biologique de RCPGs orphelins par invalidation génique.
Des expériences d’invalidation génique par recombinaison homologue sont en cours pour un nombre limité de récepteurs orphelins. Ce type d’expérience sera étendu de préférence à d’autres RCPGs orphelins pour lesquels des données nouvelles deviendraient disponibles quant à leurs agonistes (P1). Selon le domaine de physiopathologie concerné, les phénotypes seront étudiés localement (récepteurs chimiokine-like, P1, P5) ou en collaboration avec des laboratoires spécialisés étrangers (récepteurs aux neuropeptides). Des mutants spontanés de Drosophila melanogaster seront recherchés dans les collections disponibles, qui pourraient correspondre à des mutants null pour des gènes de récepteurs, et leurs phénotypes seront étudiés en détail (P2).
WP4: Etude des voies de signalisation intracellulaire des RCPGs.
Les événements « aval » engendrés par l’activation des RCPGs et les partenaires moléculaires impliqués seront étudiés par les techniques de microarrays, de protéomique et de double hybride (P1, P2, P3, P4, P5, P6). La possibilité de faire le pont entre la signalisation par RCPGs dans la levure et les eucaryotes supérieurs sera explorée par mutagénèse dirigée de récepteurs, de protéines G et de protéines RGS de levure (P1, P4).
WP5: Etude de l'implication des RCPGs en cancérogénèse.
Cette partie du projet sera principalement consacrée aux chimiokines et leurs récepteurs. Elle comprendra : (WP5.1), l’étude du profil d’expression d’une série de chimiokines et de récepteurs aux chimiokines dans des tumeurs spontanées humaines et dans des lignées tumorales murines, ovines et bovines (P1, P3, P5) ; (WP5.2) étude du rôle de récepteurs chémoattractants dans la chimiotaxie des tumeurs vers les sites préférentiels où elles établissent leurs métastases (P1, P3, P5) ; (WP5.3) étude des activités angiogéniques et angiostatiques des chimiokines et de leurs variantes dans un modèle in vivo (« micropocket model » de la cornée du lapin).
WP6: Développement de nouveaux outils pour l'étude fonctionnelle de RCPG.
L’expertise particulière de P4 dans le domaine de la transduction des signaux chez la levure sera exploitée, en collaboration avec P1 et P2, dans le but de mettre au point de nouveaux tests fonctionnels pour les RCPGs de vertébrés et d’invertébrés dans la levure. Cette approche consistera à explorer les caractéristiques fonctionnelles d’hybrides entre les protéines G alpha16 (vertébrés) et Gpa2 (S.cerevisiae).
