Onderzoeksproject P5/30 (Onderzoeksactie P5)
De coördinator en de vijf geassocieerde partners hebben een sterke positie uitgebouwd op gebied van het onderzoek naar de transductie van biologische signalen. Het doel van deze projectaanvraag is het versterken van de onderzoeksprogramma's van de individuele partners door middel van gezamenlijke actie rond een centraal thema, namelijk de studie van de G-proteïne gekoppelde receptoren ('GPCRs') die behoren tot de rhodopsine-familie. De combinatie van de expertises waarover de verschillende partners beschikken, omvat het ganse gamma aan methoden en concepten noodzakelijk voor het voeren van een efficiënt GPCR-onderzoek: functionele en vergelijkende genoomanalyse, proteomics met gebruik van de meest moderne massaspectrometers, moleculaire farmacologie, structuur-functie studies, moleculaire modellering, transgenese van muizen. Twee van de partners hebben bovendien uitgebreide expertise op gebied van signaaltransductie in gist en op gebied van de moleculaire virologie, hetgeen een extra dimensie geeft aan het project en tevens kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe methoden.
Het project wordt onderverdeeld in volgende taken of 'work packages' (WP) (de coördinator en de partners worden in de tekst geciteerd als "P1" en "P2-P6", respectievelijk. De Europese partner is vermeld als "P7"):
WP1: Functionele genoomanalyse and inverse farmacologie van GPCRs.
Dit onderzoeksonderdeel is gericht op de karakterisering van wees(kind)receptoren en de identificatie van hun natuurlijke agonisten.
Hierbij zal vooral aandacht geschonken worden aan subtypes van receptoren waarmee de partners reeds voorafgaande ervaring hebben en die op basis van hun primaire structuur gelijkenis vertonen met: chemokine-receptoren (P1,P5), neuropeptide-receptoren van vertebraten en invertebraten (P1, P2),receptoren voor angiotensine-II en verwante, fysiologisch actieve fragmenten (P1,P6), receptoren behorend tot de subfamilie van de glycoproteïne-hormoonreceptoren van vertebraten en invertebraten (P1,P2), receptoren die bij vertebraten en invertebraten vermoedelijk functioneren als glucose sensors (P4, P1, P2). Dit onderzoek omvat een systematische screening van natuurlijke (weefselextracten, normale lichaamsvochten, inflammatoire exudaten...) en synthetische (collecties van mogelijke liganden, banken van synthetische peptiden of van chemische producten...) moleculen, op basis van hun biologische activiteit in stabiel getransfecteerde cellen die de gewenste receptoren tot expressie brengen. Deze cellen, waarvan er reeds een serie beschikbaar zijn, werden dusdanig genetisch gemanipuleerd dat ze een vlotte detectie van receptoragonisten toelaten, ongeacht de aard van de regulatorische cascade die normalerwijze door de receptor wordt gestuurd. Tevens zal de weefseldistributie van de geselecteerde receptoren worden onderzocht met behulp van immunohistochemie en in situ hybridisaties.
WP2: moleculaire farmacologie, structuure functie studieen.
De moleculaire stappen en spelers die betrokken zijn bij de effecten van agonisten, antagonisten of inverse agonisten zullen worden onderzocht voor een reeks van receptoren met behulp van een combinatie van conventionele bindingsstudies, activatiestudies met getransfecteerde cellen, plaatsgerichte mutagenese en moleculaire modellering (P7). De receptoren die voor deze studies zullen geselecteerd worden zijn er waar de partners reeds sinds lange tijd een wetenschappelijke interesse voor hebben: glycoproteïne hormoonreceptoren en homologen ervan bij invertebraten (P1, P2); tachykinin receptoren bij insecten (P2); chemokine receptoren (P1, P5), receptoren voor angiotensine II en fysiologisch actieve fragmenten ervan (P6), sucrose/glucose sensoren in gist (P4).
WP3: studie van de biologische rol van wees en gekende GPCR's met behulp van geninaktivatie.
Op dit ogenblik worden klassieke KO experimenten uitgevoerd bij muizen voor een beperkt aantal weesreceptoren. Deze experimenten zullen uitgebreid worden met de GPCR's waarvoor de natuurlijke agonist werd geïdentificeerd (P1). Afhankelijk van het betrokken domein zullen de fenotypes lokaal worden bestudeerd (chemokine-achtige receptoren, P1, P5) of in samenwerking met gespecialiseerde groepen in het buitenland (neuropeptide receptoren). In collecties van spontane mutanten van Drosophila melanogaster zal gezocht worden naar mutanten die overeenkomen met KO mutanten voor receptorgenen en hun fenotypes zullen in detail worden bestudeerd (P2).
WP4: studie van de stroomafwaartse signalering door GPCR's.
De stroomafwaartse gebeurtenissen die in gang worden gezet door GPCR activatie en de interagerende partnermolecules die daarbij betrokken zijn zullen worden bestudeerd met behulp van micro-array technologie, proteomics and two-hybrid analyse (P1, P2, P3, P4, P5, P6). De mogelijkheid om de brug te slaan tussen signalering bij gist en hogere eukaryoten zal worden geëxploreerd met behulp van plaatsgerichte mutagenese van gistreceptoren, G-proteïnes en RGS proteïnes (P1, P4).
WP5 : Studie van de rol van GPCR’s in carcinogenese en metastase.
Dit deel van de studie heeft vooral betrekking op receptoren van chemokinen en verwante moleculen. Dit onderdeel omvat : (WP5.1) Bepaling van het expressieprofiel van een reeks chemokinen en chemokinenreceptoren in spontane humane tumoren en in tumorcellijnen van de muis, het schaap en het rund (P1,P3,P5); (WP5.2) Studie van de rol van chemoattractantreceptoren in de migratie van tumorcellen naar de weefsels waar ze preferentieel metastaseren (P1,P3,P5); (WP5.3) Studie van de angiogene versus angiostatische activiteit van chemokinen en hun varianten in een in vivo model (corneamodel van het konijn) (P5);
WP6 : Ontwikkeling van bijkomende hulpmiddelen voor de expressie of detectie van GPCR’s.
De expertise van Partner 4 met betrekking tot signaaltransductie in gisten zal gebruikt worden om, in samenwerking met de coördinator en Partner 2, mogelijk nieuwe biologische testen te ontwikkelen voor het activeren van GPCR’s van vertebraten en invertebraten in gisten. De aanpak hiertoe omvat het onderzoek in gisten van functionele karakteristieken van hybride G alfa-proteïnen samengesteld uit G alfa 16 van zoogdieren en Gpa2 van gisten.
