Onderzoeksproject P5/33 (Onderzoeksactie P5)
Het hoofddoel van deze IUAP aanvraag is bij te dragen tot de opheldering van 3 problemen die in verband staan met de structuur van eiwitten en van hun interacties met andere eiwitten, met nucleïnezuren of/en met kleine moleculen. Enigszins arbitrair kan deze problematiek opgedeeld worden in 3 richtingen, welke echter sterk overlappen : de opvouwing van eiwitten, de katalytische aktiviteit en het bestaan van ‘complexe systemen’. Zowel theoretische als experimentele benaderingen zullen worden uitgevoerd. Het modelsysteem dat wordt gekozen is dat van de bacteriële resistentie tegen antibiotica, wat uiteraard belangrijke implicaties inhoudt voor het in stand houden van de menselijke gezondheid.
1. Opvouwing van eiwitten
De modeleiwitten zijn lysozyme, ‘active-site’ serine- en Zn2+ -bêta-lactamasen, en fragmenten van enkel-keten antilichamen uit kameel die tegen deze enzymen worden opgewekt. Benevens de analyse van de ‘pathways’ van opvouwing van de individuële eiwitten zal de invloed van genoemde antilichamen en, in desbetreffende geval van de metaalionen, op de opvouwing en ontvouwing van de eiwitten bestudeerd worden. In parallel zal een theoretische benadering ontwikkeld worden, gebaseerd op de karakteristieke eigenschappen van de aminozuurzijketens zoals die kunnen afgeleid worden uit de analyses van de databanken over eiwitstructuren.
2. Katalytische activiteit en structuur-functie verwantschap
De modelenzymen herkennen bêta-lactam antibiotica, D-aminozuren of D-aminozuur bevattende peptiden, of meerdere van deze structuren. DD-peptidasen, ook gekend als penicilline-bindende eiwitten (PBPs) zijn de doelwitten van bêta-lactam antibiotica in bacteriën. Zij vertonen een zeer variabele gevoeligheid t.o.v. deze verbindingen, en sterk resistente enzymen liggen aan de basis van het ontstaan van penicilline resistente Enterococci en Staphylococci. Van vergelijkbaar belang zijn hoge-moleculair gewichts PBPs welke potentieel nieuwe doelwitten zijn voor de ontwikkeling van antibacteriële middelen. De transglycolase-activiteit wordt gedragen door het N-terminale domein terwijl het C-terminale domein de transpeptidasereactie katalyseert. Het is onze bedoeling structurele informatie te bekomen over beide domeinen, het verband te doorgronden tussen de twee reacties, en inhibitoren te ontwerpen van het transglycolase. De bêta-lactamases zijn verantwoordelijk voor de meeste resistentiefenomenen. We zullen het reeds door ons gedaan onderzoek voortzetten over de werkingsmechanismen van de enzymen en het ontwerpen van nieuwe inhibitoren. Tensotte zijn er de D-alanylaminopeptidasen welke niet gevoelig zijn aan penicilline ondanks het feit dat ze op D-Ala-D-Ala eindigende peptiden herkennen. De analyse van de structuur van deze ‘active sites’ moet licht werpen op de interacties die verantwoordelijk zijn voor de herkenning door verschillende enzymen. De katalytische pathway van al deze enzymen zal bestudeerd worden door ab initio theoretische chemische methoden teneinde informatie te bekomen over de structuur van de stabiele en instabiele intermediairen, in het bijzonder over de transitietoestanden.
3. Complexe systemen proteoomanalyse en biochemische benaderingen
Indien bij bacteriën de inactivatie van het transpeptidase veroorzaakt wordt door de aanwezigheid van penicilline kan men aannemen dat additionele fenomenen kunnen plaatsvinden zoals autolytische activatie en bêta-lactamase inductie. We wensen te onderzoek wat de reacties zijn van de bacteriële cellen in de aanwezigheid van penicilline, zowel door het proteoom te analyseren als door te zoeken naar enzymactiviteiten of naar metabolische concentraties. Het fenomeen van celdeling is een verwant proces waarbij hoogmoleculaire gewichts PBPs betrokken zijn, samen met een groot aantal andere eiwitten welke een supra-moleculair geheel vormen, het divisoom. De structuur van het divisoom zal onderzocht worden. Tenslotte zal een belangrijk deel van het onderzoek gaan over biofilmvorming aangezien men zich meer en meer bewust wordt van het feit dat dit fenomeen zeer dikwijls geassocieerd is met pathogeniciteit. De celadhesieproteïnen die hiervoor verantwoordelijk zijn zullen op alle niveaus van de structuuropheldering bestudeerd worden.
