Projet de recherche P6/15 (Action de recherche P6)
Les mécanismes moléculaires employés par les parasites pour subir les transformations nécessaires à leur développement et s’adapter à leurs hôtes sont relativement mal connus. En continuation directe des résultats obtenus au cours de notre collaboration précédente (P5/29), nous proposons d’utiliser les trypanosomes africains (prototype Trypanosoma brucei) comme organismes modèles pour étudier différents aspects du dialogue entre les parasites et leurs hôtes.
A. Etudes sur le parasite
1. Endocytose des macromolécules de l’hôte (TCD, ULB)
a- Caractérisation de la machinerie endocytaire. Chez T. brucei, les récepteurs de surface et la machinerie endocytaire sont regroupés dans une région spécialisée de la surface cellulaire, appelée la poche flagellaire. Nous avons entrepris la caractérisation de ces protéines par une approche protéomique de la fraction cellulaire contenant, ou associée avec, le signal de trafic endocytaire identifié lors de notre travail précédent dans la collaboration PAI (chaînes linéaires de poly-N-acétyllactosamine). Nous proposons de continuer ce travail. Nous comptons particulièrement focaliser notre attention sur les composants impliqués dans la capture et l’intériorisation du facteur trypanolytique apolipoprotéine L-I (apoL-I).
b- Mécanisme de résistance de T. b. gambiense à l’apoL-I (ULB)
T. b. gambiense est capable de résister à l’activité trypanolytique de l’apoL-I, et le mécanisme de cette résistance duffère de celui que nous avons caractérisé pour T. b. rhodesiense pendant la phase V de notre collaboration PAI. Nous proposons de suivre trois approches pour étudier cette question : (1) l’évaluation de l’implication possible d’une protéine de type récepteur que nous avons montré être totalement spécifique de la sous-espèce gambiense (TgsGP) ; (2) l’analyse du processus de fixation et d’intériorisation de l’apoL-I chez T. b. gambiense ; (3) le criblage systématique de gènes pouvant être impliqués dans la résistance à l’apoL-I, par l’utilisation d’une mutagénèse médiée par un transposon.
c- Etudes sur l’apoL-I et les apoLs (ULB, VUB, TCD)
Chez l’homme l’apoL-I appartient à une famille de six membres, et représente le seul membre de la famille à être sécrété dans le milieu extracellulaire. La fonction de ces protéines est inconnue. Notre travail précédent sur l’activité trypanolytique de l’apoL-I a révélé la capacité de cette protéine à générer des pores anioniques dans des membranes cellulaires telles que la membrane lysosomiale de T. brucei. Nous proposons de bâtir sur nos connaissances acquises pour détailler la fonction des apoLs. En ce qui concerne l’apoL-I nous comptons particulièrement étudier son potentiel d’interaction avec l’”haptoglobin-related protein” (Hpr), et nous allons poursuivre le développement d’immunotoxines générées par la fusion de l’apoL-I avec des « nanobodies » (anticorps constitués d’un seul domaine) ciblant la surface du parasite. En ce qui concerne les autres apoLs nous allons étudier le phénotype de différents types de cellules humaines transfectées avec des versions étiquetées de ces protéines recombinantes, soit de type sauvage soit mutées de manière telle à sonder leur structure et leur fonction à partir de ce que nous avons découvert à propos de l’apoL-I. D’après nos résultats préliminaires, nous proposons de détailler l’interaction possible entre apoLs et les protéines apoptotiques de la famille Bcl-2. Dans ce contexte, nous comptons générer des souris KO pour le groupe de gènes d’apoL.
2. Signalisation cellulaire (LMUM, ULB)
Etant donné que l’AMP cyclique (cAMP) est un acteur crucial de la signalisation chez les kinétoplastidés, nous proposons de rechercher en profondeur les mécanismes impliqués dans la synthèse de cette molécule (activation de l’adénylate cyclase), ainsi que le rôle joué par le cAMP dans la prolifération et la différenciation cellulaire (implication de protéine kinase A ?). En particulier, le phénotype de différents mutants “dominant-négatifs” de l’adénylate cyclase, obtenus lors de la phase V de notre collaboration PAI, sera analysé en détails car ce phénotype suggère une implication du cAMP dans l’échappement du parasite aux défenses immunes. En outre, nous comptons essayer de déterminer si le phénotype de mobilité observé lors de la sous-expression d’une protéine kinase A est lié à ces processus. Enfin, nous proposons de développer in crible RNAi et un essai basé sur le FACS afin d’identifier des gènes importants pour le processus de différentiation des formes sanguicoles en formes procycliques.
3. Contrôles de l’expression des gènes (ULB)
Les contrôles agissant sur l’expression des gènes de l’antigène majeur du parasite, le « Variant Surface Glycoprotein » (VSG), représentent un paradigme des contrôles responsables de la différenciation cellulaire chez T. brucei. Comme les autres gènes, les gènes de VSG sont contenus dans des unités de transcription polycistroniques (appelées ici « VSG expression sites » ou ESs) dont le niveau de production d’ARN messager individuel à partir de chaque gène est contrôlé de façon post-transcriptionnelle. Mais, en outre, un contrôle mono-allélique n’autorise seulement la transcription que d’un seul ES à la fois dans les formes sanguicoles, tandis qu’aucun de ces sites n’est actif dans les formes procycliques. Enfin, les promoteurs de transcription des ESs sont de type ribosomique, et recrutent une RNA polymérase de type I (RNA Pol I). Notre objectif majeur est d’identifier les mécanismes contrôlant la RNA Pol I sur les ESs. Nous comptons caractériser la machinerie transcriptionnelle impliquée, ainsi que les facteurs associés. En particulier, nous allons analyser le complexe multifactoriel d’élongation de l’ARN et de réparation de l’ADN appelé TFIIH, et étudier la signification fonctionnelle des isoformes des sous-unités RPB5 et RPB6 spécifiques de la RNA Pol I, découvertes lors de notre travail antérieur dans le cadre du programme PAI. Enfin, une autre protéine d’intérêt est PIE8. Cette protéine semble faire part d’un complexe nucléaire contrôlant le passage de la mitose à la cytokinèse. Nous comptons caractériser les protéines associées à PIE8.
4. Changements métaboliques pendant le cycle de développement du parasite
a- Renouvellement et autophagie des glycosomes (UCL, ULB, ITG)
Différents systèmes métaboliques des trypanosomes sont séquestrés dans des organites semblables aux peroxisomes, et appelés glycosomes. A l’aide du système modèle développé lors de la phase V de notre collaboration PAI, des indications préliminaires ont suggéré que la dégradation des glycosomes qui se produit lors de la différenciation du parasite implique une forme particulière d’autophagie, appelée pexophagie. Nous proposons de poursuivre ces études, ainsi que celles concernant la biogenèse des glycosomes, et de décrypter les détails des mécanismes à l’œuvre. De plus, nous comptons étendre ce travail à l’analyse du processus de renouvellement des glycosomes lors des différentes étapes de différenciation du parasite, quand il passe, dans l’insecte vecteur, du tube digestif au proboscis et ensuite aux glandes salivaires, où il se transforme en forme infectieuse pour le mammifère.
b- Fonctions mitochondriales au cours du cycle de développement (LMUM, UCL, ULB, ITG)
En complément au travail sur le renouvellement des glycosomes, nous allons étudier le contrôle développemental du métabolisme énergétique de la mitochondrie, et le contrôle coordonné de l’expression génétique des enzymes concernés. Nous comptons identifier les mécanismes de signalisation qui coordonnent la biogenèse et la dégradation des deux organites producteurs d’énergie au cours du cycle de développement parasitaire. Nous suggérons que l’aconitase cytoplasmique et la isocitrate-déshydrogénase glycosomique sont requises pour la production de NADPH et la défense au stress oxidatif dans les glycosomes. La signification de ce circuit métabolique sera analysée par transmission cyclique, dans la mouche tsétsé, de lignées de parasites invalidés pour les différents gènes concernés.
B. Etudes des interactions hôte-parasite
1. Mécanismes impliqués dans la pathologie de l’hôte mammifère (VUB)
Lors de notre travail PAI antérieur, nous avons montré que la tolérance de l’hôte au trypanosomes et le contrôle de l’immunopathologie nécessitent l’expansion séquentielle des cellules myéloïdes activées par la voie « classique » (M1), puis des cellules myéloïdes activées par la voie « alternative » (M2) ainsi que des cellules T régulatrices (Treg). Ainsi, les cellules M1 contrôlent la croissance du parasite, mais contribuent également à l’immunopathologie, tandis que les cellules M2 et Treg protègent l’hôte contre l’immunopathologie par un mécanisme dépendant de la sécrétion d’IL-10. Nous proposons d’étudier, dans le foie et la moelle osseuse, le rôle joué par les produits des gènes exprimés sélectivement dans les cellules M1, M2 et Treg dans l’induction ou la protection contre l’immunopathologie. Ceci sera effectué dans des animaux qui sont naturellement trypanotolérants ou qui sont rendus trypanotolérants par traitement avec du GPI. D’autre part, nous avons identifié des gènes activés dans les cellules M1 par des constituants parasitaires, et dont l’expression pourrait contribuer au développement de l’anémie, une caractéristique de la pathologie induite dans la trypanosomiase africaine. La contribution de ces facteurs à l’induction de l’anémie sera étudiée.
2. Interactions entre cellules myéloïdes et trypanosomes (VUB, ULB)
Nous comptons élucider le rôle dans le développement de la maladie, des protéines qui activent les cellules M1 et M2 (kinesin heavy chain, TSIF, GPI, complexes immuns...), et qui ont été identifiées au cours de la phase précédente du programme PAI. Les gènes-cibles de ces immunomodulateurs seront sélectionnés à l’aide de microdamiers reflétant l’activation des cellules myéloïdes, que nous avons récemment développés, afin d’identifier leur mécanisme d’action et leur influence sur le développement de la maladie.
3. Interactions entre mouche tsétsé et trypanosomes (ITG, ULB, VUB,UCL)
Au cours de la phase finale de leur développement dans la mouche, les trypanosomes s’attachent étroitement à la surface de l’épithélium des glandes salivaires de l’insecte, réactivent leur cycle de multiplication et, après une suite complexe de changements cellulaires, se transforment en formes métacycliques libres qui sont adaptées à la vie dans le sang du mammifère, où elles sont injectées avec la salive de la mouche. Nous proposons de focaliser notre étude sur (1) le complexe jonctionnel entre le parasite épimastigote et l’épithélium de la glande salivaire, (2) les processus de croissance et de différenciation du parasite dans les glandes salivaires, et (3) le développement précoce des trypanosomes au site de piqûre dans l’hôte mammifère. Par une approche basée sur la spectrométrie de masse, on identifiera les protéines de l’épithélium qui sont candidates pour être impliquées dans le complexe jonctionnel tsétsé-parasite. La technique d’extinction de l’activité génique, développée chez la mouche tsétsé dans le cadre de notre travail PAI précédent, sera exploitée pour établir le rôle des protéines de la salive dans la croissance et la différenciation du trypanosome dans les glandes salivaires. On donnera une priorité aux gènes codant pour les protéines de la salive dont une fonction peut être prédite dans la stimulation de la croissance cellulaire, ou dans la décomposition de l’ATP, l’ADP et des nucléotides en purines. Dans le contexte de l’interaction entre la salive de la tsétsé et le développement du parasite chez l’hôte mammifère, le travail sera focalisé sur la compréhension de l’activité promotrice des protéines salivaires sur le développement précoce du trypanosome au site d’inoculation dans l’hôte.
