Onderzoeksproject P6/15 (Onderzoeksactie P6)
De moleculaire mechanismen die door parasieten gebruikt worden bij de overgang tussen de verschillende stadia van hun levenscyclus om zich aan te passen aan hun gastheer zijn slechts beperkt gekarakteriseerd. In direkte navolging op de resultaten behaald tijdens de vorige samenwerking (P5/29), stellen we voor om Afrikaanse trypanosomen (met als prototype Trypanosoma brucei) te gebruiken als modelorganismen om verschillende aspecten van de wisselwerking tussen parasieten en hun gastheren te bestuderen.
A. Studies op de parasiet
1. Endocytose van macromoleculen van de gastheer (TCD, ULB)
a- Karakterisering van de endocytotische machinerie. In T. brucei zitten de oppervlaktereceptoren en de endocytotische machinerie samengepakt in een gespecialiseerd gebied van het celoppervlak, de flagellaire holte. We hebben de karakterisering van deze eiwitten opgestart via een proteoomanalyse van de celfractie die het endocytisch sorteersignaal, geïdentificeerd tijdens onze vorige IAP samenwerking (lineaire ketens van poly-N-acetylgalactosamine), omvat of bindt en we stellen voor dit werk verder te zetten. We zullen in het bijzonder de nadruk leggen op componenten betrokken in de opname van de trypanolytische factor apolipoproteine L-I (apoL-I).
b- Mechanisme van resistentie van T. b. gambiense tegen apoL-I (ULB).
T. b. gambiense is resistent tegen de trypanolytische activiteit van apoL-I en het mechanisme van deze resistentie verschilt van datgene wat we gekarakteriseerd hebben voor T. b. rhodesiense tijdens fase V van onze IAP samenwerking. We stellen voor drie verschillende benaderingen te gebruiken om deze vraag te beantwoorden: (i) evaluatie van de mogelijke betrokkenheid van een receptor-achtig eiwit waarvan we aangetoond hebben dat het volledig specifiek is voor de gambiense subspecies (TgsGP), (ii) studie van het proces van apoL-I binding en opname in T. b. gambiense, en (iii) systematisch opsporen van genen betrokken in apoL-I resistentie via transposon-gemedieerde mutagenese.
c- Studies op apoL-I en apoL’s (ULB, VUB, TCD).
Bij de mens behoort apoL-I tot een familie van zes leden en het is het enige lid van deze familie dat extracellulair gesecreteerd wordt. De functie van deze eiwitten is momenteel onbekend. Ons voorafgaand werk op de trypanolytische activiteit van apoL-I heeft de capaciteit van dit eiwit blootgelegd om anionische poriën te genereren in celmembranen zoals het lysosomaal membraan van T. brucei. We stellen voor verder te bouwen op onze opgedane expertise om de functie van apoLs te bestuderen. Wat apoL-I betreft, zullen we in het bijzonder de mogelijke interactie hiervan met haptoglobine-gerelateerd proteïne (Hpr) bestuderen en de ontwikkeling verfijnen van trypanotoxines bestaande uit de fusie van apoL-I met nanobodies (enkele domein antilichamen) die aan het parasietoppervlak binden. Met betrekking tot de intracellulaire apoL’s, zullen we het fenotype bestuderen van verschillende types humane cellen na transfectie met gemerkte versies van deze recombinante eiwitten, hetzij wild-type, hetzij gemuteerd, om hun structuur en functie te onderzoeken gebaseerd op wat we gevonden hebben voor apoL-I. Steunend op onze preliminaire resultaten, stellen we voor de mogelijke wisselwerking tussen apoL’s en apoptotische eiwitten van de Bcl-2 familie verder uit te diepen. In dit verband zijn we van plan KO muizen voor de apoL gencluster te genereren.
2. Celsignalisatie (LMUM, ULB)
Aangezien cyclisch AMP (cAMP) een cruciale speler is in trypanosoomsignalisatie, stellen we voor de mechanismen betrokken in de synthese van dit molecule (activering van adenylaat cyclase) grondig te bestuderen, alsook de rol van cAMP in celproliferatie en –differentiatie (betrokkenheid van proteïne kinase A?). In het bijzonder zal het fenotype van verschillende dominant negatieve mutanten van adenylaat cyclase, bekomen tijdens fase V van onze IAP samenwerking, grondig bestudeerd worden aangezien dit fenotype een kritische betrokkenheid van cAMP in het ontsnappen van de parasiet aan gastheerimmuniteit suggereert. Daarnaast zullen we trachten na te gaan of het mobiliteitsfenotype, waargenomen bij verlaagde expressie van een proteïne kinase A-achtig eiwit, gerelateerd is aan deze processen. Tenslotte stellen we ook voor een RNAi-gebaseerde selectiemethode en een FACS-gebaseerde test te ontwikkelen om genen te identificeren die belangrijk zijn bij de differentiatie van bloedstroom- naar procyclische vormen.
3. Controles van genexpressie (ULB)
De controles die werkzaam zijn in de expressie van de genen voor het Variant Oppervlakte Glycoproteïne (“Variant Surface Glycoprotein”; VSG) vormen een paradigma voor deze die verantwoordelijk zijn voor de cellulaire differentiatie van T. brucei. Net zoals andere genen, zijn de VSG genen omvat in polycistronische transcriptie-eenheden (hier VSG “expression sites”, ES’s, genoemd) waarvan het niveau van mRNA productie vanaf elk gen post-transcriptioneel gecontroleerd wordt. Maar daarenboven laat in bloedstroomvormen een mono-allelische controle enkel maar de transcriptie toe van één enkele ES tegelijk, terwijl geen van deze sites actief is in insect-specifieke procyclische vormen. Tenslotte zijn de transcriptionele promoters van de ES’s van het ribosomale type en recruteren ze RNA polymerase I (RNA pol I). Ons hoofddoel is de mechanismen te identificeren die de RNA pol I op de ES’s controleren. We willen de relevante transcriptiemachinerie en geassocieerde factoren karakteriseren. In het bijzonder zullen we de multi-subeenheid RNA elongatie en DNA herstel factor TFIIH analyseren en de functionele relevantie bestuderen van de RNA pol I-specifieke isovormen van de RPB5 en RPB6 subeenheden, ontdekt tijdens ons voorafgaande werk in het IAP programma. Een ander eiwit waarin we geïnteresseerd zijn is PIE8 dat deel schijnt uit te maken van een complex in de celkern dat de overgang van mitose naar cytokinese controleert. We zijn van plan de eiwitten te karakteriseren die associëren met PIE8.
4. Metabolische veranderingen tijdens de levenscyclus van de parasieten
a- Glycosoomturnover en -autofagie (UCL, ULB, ITG).
Verschillende metabolische systemen van trypanosomen zitten samengepakt in peroxisoom-achtige organellen die glycosomen genoemd worden. Gebruikmakend van het modelsysteem dat ontwikkeld is tijdens fase V van onze IAP samenwerking, zijn er preliminaire aanwijzingen bekomen dat autofagie betrokken is bij de glycosoomdegradatie tijdens differentiatie. We stellen voor deze studies aan autofagie van glycosomen, ook wel pexofagie genoemd, en ook onze studies aan de biogenese van nieuwe glycosomen, en de details van het mechanisme te ontrafelen. We zullen bovendien onze studies op glycosoom’turnover’ uitbreiden tot de verschillende differentiatiestappen van de parasieten wanneer ze, in de tseetseevlieg, migreren van de middendarm naar de proboscis en vervolgens naar de speekselklieren, waar ze uiteindelijk ontwikkelen tot het stadium dat infectieus is voor de zoogdiergastheer.
b- Mitochondriale functies tijdens de levenscyclus (LMUM, UCL, ULB, ITG).
Complementair aan het werk op de glycosoom’turnover’ zullen we de regulatie van het mitochondriaal energiemetabolisme tijdens de ontwikkeling bestuderen, alsook de genexpressie van de betrokken enzymen. We hebben hierbij als doel signalisatiemechanismen te identificeren die de biogenese/degradatie van de twee energie-producerende organellen tijdens de levenscyclus coördineren. We stellen voorop dat cytoplasmatisch aconitase en glycosomaal isocitraat dehydrogenase nodig zijn voor NADPH productie en bescherming tegen oxidatieve stress in glycosomen. De relevantie hiervan zal geanalyseerd worden door de ontwikkeling te volgen in de tseetseevlieg van pleiomorfe parasietlijnen die deficiënt gemaakt zijn in de verschillende betrokken genen.
B. Studies van de gastheer-parasiet interacties
1. Mechanismen betrokken in pathologie van de zoogdiergastheer (VUB)
Tijdens ons voorafgaand IAP werk hebben we aangetoond dat trypanotolerantie en controle van immunopathologie zowel de opeenvolgende expansie van eerst klassiek geactiveerde myeloïde cellen (M1) en vervolgens alternatief geactiveerde myeloïde cellen (M2) alsook regulatorische T cellen (Treg) vereist. Zo controleren M1 parasietgroei, maar dragen tegelijk ook bij tot immunopathologie, terwijl M2 en Tregs op een IL-10-afhankelijke wijze de gastheer beschermen tegen immunopatholgie. We stellen voor, in de lever en het beenmerg, de rol van genproducten uitgedrukt door M1 of M2 en/of Treg in opwekken van of bescherming tegen immunopathologie te bestuderen. Dit zal uitgevoerd worden in dieren die van nature uit trypanotolerant zijn, of die trypanotolerant gemaakt zijn via GPI behandeling. Anderzijds hebben we ook M1-geassocieerde genen en parasietcomponenten geïdentificeerd die mogelijk bijdragen tot het ontwikkelen van anemie, een ander kenmerk van de pathologie opgewekt tijdens Afrikaanse trypanosomose. De bijdrage van deze factoren tot de ontwikkeling van anemie zal bestudeerd worden.
2. Interacties tussen myeloïde cellen en trypanosomen (VUB, ULB)
We zullen de rol van M1- en M2-inducerende eiwitten (kinesine zware keten, TSIF, GPI, immune complexen), geïdentificeerd tijdens de voorfgaande fase van het IAP, in het verloop van de ziekte bestuderen. Aan de hand van een microarray met myeloide cel-geassocieerde genen die we recent ontwikkeld hebben, zullen we genen selecteren waarvan de expressie beïnvloed wordt door deze immunomodulatoren en die kandidaten vormen voor hun werkingsmechanisme en hun effect op het verloop van de ziekte te identificeren.
3. Interacties tussen de tseetseevlieg en de trypanosoom (ITG, ULB, VUB, UCL)
In de laatste fase van hun ontwikkeling in de vlieg hechten trypanosomen zich stevig vast aan het epitheliale oppervlak van de speekselklieren van het insect. Daarbij gaan ze opnieuw over tot celvermenigvuldiging en, na een complexe opeenvolging van cellulaire veranderingen, worden vrije metacyclische vormen gegenereerd die aangepast zijn aan het leven in de zoogdiergastheer, waarin ze geïnjecteerd worden samen met het speeksel van de tseetseevlieg. Het vooropgestelde werk zal zich richten op (i) het bindingscomplex dat gevormd wordt tussen de epimastigoot parasieten en het speekselklierepitheel, (ii) de groei en differentiatie van de parasiet in de speekselklieren en (iii) de vroege ontwikkeling van de trypanosomen op de plaats van de beet in de zoogdiergastheer. Via een proteomische benadering, gebaseerd op massaspectrometrie, zullen epithelium-geassocieerde eiwitten die mogelijk betrokken zijn in de nauwe tseetsee-parasiet interactie geïdentificeerd worden. De op RNAi gebaseerde methode voor het onderdrukken van genexpressie in tseetseevliegen, ontwikkeld tijdens het voorafgaande IAP werk, zal gebruikt worden om de rol na te gaan van specifieke speekselkliereiwitten in de groei en differentiatie van de trypanosoom in de speekselklier. Er zal prioriteit gegeven worden aan genen die coderen voor eiwitten waarvan een rol kan voorspeld worden in de stimulatie van de celgroei of in de afbraak van ATP, ADP en nucleotiden. In verband met de interactie tussen tseetseevliegspeeksel en de ontwikkeling van trypanosomen in de zoogdiergastheer, zal het werk vooral gericht zijn op het ontrafelen van de transmissie-verhogende activiteit van speekseleiwitten tijdens de vroege ontwikkeling van de trypanosoom, ter hoogte van de inoculatieplaats in de gastheer.
