Onderzoeksproject P6/19 (Onderzoeksactie P6)
De recent ontwikkelde methoden voor DNA sequentieanalyse leiden tot een enorme hoeveelheid informatie over het genetische materiaal van een steeds groter aantal levende organismen. We slagen er echter onvoldoende in om deze gegevens te integreren om uiteindelijk de werking van de levende cellen in detail te begrijpen. Om deze paradox te vatten, moeten we rekening houden met het feit dat onze kennis over de interacties die tussen de karakteristieke moleculen van levende materie plaatsvinden veel minder snel vooruitgaat in vergelijking met de bepaling van de genoomsequenties. Eiwitten zijn zonder twijfel de biologische macromoleculen die het meest bijdragen tot de functionering van cellen. Het gedrag van cellen wordt in sterke mate bepaald door het fenomeen van de moleculaire interacties : de tertiaire structuur van eiwitten en de dynamiek van deze structuren hangen sterk af van de intramoleculaire interacties, terwijl de quaternaire structuren en de associatie van eiwitten met liganden van diverse omvang op intermoleculaire interacties berusten. Deze liganden kunnen substraten, inhibitoren, effectoren, nucleïnezuren, lipide dubbellagen of andere eiwitten zijn. Ongewenste wijzigingen in deze interacties kunnen leiden tot een omzetting van een normaal tot een ongewenst proces, waaruit diverse ziekten kunnen volgen. Anderzijds berust de werking van antimicrobiële chemotherapie precies op het verstoren van de metabole processen van de parasiet. Het hier voorgestelde netwerk stelt zich tot doel om de meest fundamentele aspecten van de werking van eiwitten te bestuderen om het hierboven vermelde hiaat te vullen.
Opdat een eiwit zijn normale functie zou vervullen, moet het vooreerst correct gaan opvouwen tot een specifieke structuur. Van steeds meer ernstige ziekten stelt men vast dat ze gerelateerd zijn met afwijkingen in dit opvouwingsproces, wat soms leiden tot de aggregatie van eiwitten met vorming van amyloïde vezels of plaques. In het geval van een normale opvouwing kunnen we stellen dat een opmerkelijke coöperativiteit van de structuur de intramoleculaire interacties bevordert. Vermindering van deze globale coöperativiteit (bv. ten gevolge van mutaties), daarentegen, kan aanleiding geven tot transities naar abnormale opvouwingen met als resultaat de vorming van intermoleculaire interacties, wat uiteindelijk leidt tot aggregatie.
Een eerste doelstelling van dit project is dus gericht op het begrijpen van de mechanismen van de transitie van normale naar abnormale eiwitstructuren, en op het identificeren van de factoren die ons zouden toelaten om deze transitie te verhinderen of af te remmen. Terwijl vandaag de kennis van het opvouwingsmechanisme van kleine eiwitten (gewoonlijk minder dan 100 aminozuren) vrij goed gekend is, zien we dat dit helemaal niet meer geldt voor membranaire eiwitten en voor moleculen met een groter moleculair gewicht. De studie van het gedrag en stabiliteit van dergelijke eiwitten, alsook het effect van eventuele liganden (cofactoren, inhibitoren, substraten of andere eiwitten) op dit gedrag zal een belangrijk aandeel vormen van onze benadering. Een tweede en hieraan nauw verbonden facet zal handelen over de dynamiek van eiwitten. Het is algemeen aanvaard dat de instabiliteit van eiwitten in verband kan gebracht worden met hun flexibiliteit, maar dat die flexibiliteit tevens vereist is voor de goede functionering ervan. Het functionele gedrag van een eiwit is dus het resultaat van een delicate balans tussen stabiliteit en flexibiliteit. Dit kan geïllustreerd worden aan de hand van het voorkomen van niet-gestructureerde domeinen in de natieve opvouwing van sommige eiwitten. Hiervan vermoedt men dat ze overgaan tot een unieke configuratie wanneer ze interacties met specifieke liganden aangaan.
Een tweede doelstelling is de studie van interacties tussen eiwitten en liganden. De liganden kunnen kleine moleculen (substraten, inhibitoren en effectoren), nucleïnezuren, grote structuren (zoals delen van de celenvelop) en/of andere eiwitten zijn. Het modelsysteem dat hiervoor uitgekozen is betreft eiwitten die betrokken zijn in het celwandmetabolisme van bacteriën en in de resistentie tegen -lactam antibiotica. Dit houdt in dat er verder gezocht wordt naar nieuwe antibacteriële geneesmiddelen, met als doelwitten transglycosylasen en DD-transpeptidasen die betrokken zijn bij de biosynthese van peptidoglycaan, evenals dat er een verdere studie van de . -lactamasen en van de efflux transporters wordt uitgevoerd. Deze studie vereist een aanzienlijke inspanning op het vlak van de design en modeling van nieuwe moleculen en op het vlak van de synthese van nieuwe types van inhibitoren voor enzymen en van substraten of substraatanalogen die erg moeilijk te bekomen zijn. Inductie van de synthese van -lactamasen vereist benevens DNA-eiwit en DNA-eiwit-ligand interacties ook de overdracht van boodschappen door transmembranaire eiwitten. Er is dus een duidelijke link tussen de eerste en tweede doelstelling van het project.
De DD-transpeptidasen/ transglycosylasen interageren met andere eiwitten waarbij membraangeassocieerde supramoleculaire structuren gevormd worden die betrokken zijn bij celgroei en celdeling. Dit brengt ons bij de derde doelstelling: de studie van eiwit-eiwitinteracties en van hun vorming en dissociatie in functie van de cellulaire fysiologische toestand. Dit staat in verband met de eerste doelstelling van het project met betrekking tot de stabiliteit van de suprastructuren en impliceert de studie van structuren van membranaire eiwitten waarvoor, ondanks recente successen, toch nog steeds belangrijke technische problemen moeten omzeild worden. Eiwit-eiwitinteracties hebben ten slotte ook nog invloed op de vorming van biofilm, een fenomeen dat nauw verband in staat met bacteriële antibioticaresistentie en pathogenese, en, zoals recent aangetoond, ook met het peptidoglycaanmetabolisme.
Globaal gezien stelt dit project dus een gradatie voor: van de studie van het gedrag van individuele moleculen en van intramoleculaire krachten (een benadering die versterkt wordt door de bijdrage van theoretische chemici) tot dat van stabiele of transiënte supramoleculaire netwerken.
Dit ambitieuze programma vereist de analyse van een diversiteit aan modelsystemen. Deze systemen werden zorgvuldig geselecteerd op basis van de ervaring van de deelnemende groepen waarbij een belangrijk deel van het programma gewijd is aan het fenomeen van bacteriële resistentie tegen antibiotica, waarvan de studie duidelijk bijdraagt tot de drie voorgestelde doelstellingen. Daarnaast vertegenwoordigen de problemen gerelateerd met eiwitdynamica, inclusief de vorming van amyloïde vezels een belangrijke aanpak met zeer belangrijke toepassingen in het medische veld.
Om een bijdrage tot de oplossing van deze problemen op de meest efficiënte manier te realiseren, werd een samenwerking opgezet tussen de beste Belgische teams op het vlak van de eiwitstudies. Deze groepen (Figuur 1) zullen de beste technologieën inzetten die beschikbaar zijn in de moleculaire en structurele biologie, bacteriologie, biofysica, bioinformatica, eiwit-en membraanchemie, organische synthese en theoretische scheikunde. De bijdrage van de Europese partner (Cam-UK, Dobson) is uitzonderlijk van belang in het domein van de biofysica, structurele biologie en eiwitchemie. De kristallografen hebben een geprivilegieerde toegang tot de ESRF faciliteiten in Grenoble. Daar waar mogelijk en zinvol zal er tot uitwisseling van technologie tussen de deelnemende laboratoria overgegaan worden.
