Projet de recherche P6/31 (Action de recherche P6)
L’excitabilité électrique est une caractéristique majeure des organes vitaux que sont le cœur et le cerveau. Les modifications transitoires de la différence de potentiel transmembranaire sont le résultat d’une activité hautement coordonnée de canaux ioniques et de transporteurs. Les signaux électriques appelés potentiels d’action transmettent de l’information sur de longues distances et initient des événements complexes tels que l’apprentissage, la mémorisation et la contraction du muscle cardiaque ; ils sont aussi à la base d’activités rythmiques spontanées dans le cerveau et dans le cœur. Un dysfonctionnement des canaux ioniques peut être responsable de maladies graves, congénitales ou acquises, telles que des épilepsies, des surdités et des morts subites d’origine cardiaque. Le terme de « canalopathie » est souvent utilisé pour qualifier les maladies congénitales qui résultent de mutations spécifiques de canaux.
La grande diversité des signaux électriques au sein du système nerveux central et également des différentes régions du cœur est le résultat de l’expression spécifique, au niveau cellulaire, d’une série de canaux ioniques, y compris des récepteurs ionotropiques et des transporteurs. Les canaux ioniques sont des protéines transmembranaires, le plus souvent composées de plusieurs sous-unités ; des protéines régulatrices telles que des kinases et des phosphatases peuvent également s’associer avec ces canaux pour former de larges complexes protéiques. Au sein de la membrane, ces complexes de canaux ioniques peuvent de plus être organisés dans des micro-domaines spécifiques tels que les cavéoles et les « lipid rafts»; cette organisation spatiale module également leur fonction.
Une compréhension approfondie des processus d’excitabilité normale dans le cœur et le système nerveux central exige une connaissance des propriétés de base des canaux ioniques, de leur relation structure-fonction, de leur capacité de co-assemblage, de leur « trafficking », de leur insertion dans la membrane ainsi que de leur temps de demi-vie au sein de celle-ci. La dissection des mécanismes de maladies qui sont dues à une excitabilité anormale nécessite non seulement une connaissance des propriétés de base de ces canaux, mais également de disposer d’outils permettant d’identifier de manière précise les altérations spécifiques de la fonction canalaire. Cette connaissance apportée par le décryptage des propriétés de base et des mécanismes de dysfonctionnement des canaux pourrait permettre d’envisager, dans une étape ultérieure, une base rationnelle pour des développements thérapeutiques.
Face à cette problématique générale, notre réseau présente un programme intégré pour investiguer à différents niveaux (tissulaire, cellulaire et moléculaire) l’expression, la fonction et la régulation d’un certain nombre de canaux ioniques, de transporteurs et de récepteurs ionotropiques. Les protéines que nous avons choisies sous-tendent des processus d’excitabilité normale et parfois anormale dans le cœur et le système nerveux central. Un certain nombre de propriétés conservées parmi ces molécules dans différents types cellulaires justifient et facilitent l’utilisation de plateformes et de connaissances de bases mises en commun. La fonction unique de certains de ces canaux au sein de différents tissus permettra d’enrichir les échanges et la collaboration entre les différents partenaires.
Les laboratoires participants sont des experts dans différents aspects de l’excitabilité, des canaux ioniques et des transporteurs dans les tissus normaux et pathologiques : relations structure-activité des canaux et des complexes dans lesquels ils sont intégrés (UA, D. Snyders), excitabilité cardiaque et remodelage du cœur en conditions pathologiques (KUL, K. Sipido), modulation de l’activité des canaux ioniques par des ligands spécifiques (KUL, J. Tytgat), physiologie et pharmacologie des canaux ioniques du système nerveux central (ULg, V. Seutin), communication intercellulaire dans le système nerveux central (UGent, L. Leybaert), récepteurs ionotropiques inhibiteurs (UHasselt, J.-M. Rigo). L’inclusion de deux laboratoires européens très spécialisés (UUtrecht, M. Vos, électrophysiologie cardiaque ; Université de Bristol, N. Marrion, transmission synaptique dans le système nerveux central) augmente encore le potentiel de ce réseau. À travers le PAI, notre consortium s’attaquera à des questions scientifiques qui transcendent le potentiel expérimental des laboratoires individuels.
Les objectifs spécifiques de la collaboration concernent :
- La mise en commun de plateformes technologiques
Utilisation commune d’équipements majeurs (séquenceurs, imagerie confocale, y compris l’imagerie de cellules vivantes et les enregistrements sur coupes de cerveaux) et d’outils moléculaires (clonage, mutation, expression in vitro dans une série de types cellulaires).
Notre intention est de développer des outils spécifiques pour une application au sein de notre réseau.
- La combinaison de différents niveaux d’investigation
Électrophysiologie in vivo, électrophysiologie tissulaire, enregistrements cellulaires et analyses moléculaires ; études complémentaires entre les différents laboratoires et échanges de données et de matériel ; fonctions normales et anormales dans des modèles animaux (souris transgéniques, modèles de maladies cardiaques sur grands animaux).
- Des échanges d’expertise et de connaissance
Notre objectif est de nous attaquer à des questions scientifiques plus larges grâce à l’échange de matériel et à l’utilisation de méthodes complémentaires ; nous effectuerons un échange de chercheurs post-doctoraux et nous mettrons en place au sein du réseau, un programme d’enseignement pour les doctorants.
Les activités de recherches sont organisées en sujets qui se focalisent sur les aspects mécanistiques les plus importants de l’excitabilité. Chaque sujet est consacré à un objectif de recherche spécifique :
• Définition de l’architecture moléculaire et de la pharmacologie des canaux K+ et leur rôle dans l’excitabilité
• Etude de l’activité électrique spontanée (« pacemaking ») normale et pathologique
• Caractérisation du rétrocontrôle sur l’excitabilité membranaire de modifications de [Ca2+]i
• Etude des propriétés de canaux ioniques et de récepteurs ionotropiques dans la communication cellulaire
• Plasticité de l’expression et de la fonction des canaux ioniques dans des conditions normales et pathologiques.
Plan de recherche
Sujet 1 : Architecture moléculaire des canaux K+ et leur rôle dans l’excitabilité membranaire.
L’activité des canaux K+ est déterminée par leur architecture moléculaire qui comprend une structure variable, avec le plus souvent une tétramérisation de sous-unités, un co-assemblage avec des sous-unités et des modifications secondaires. Une analyse des relations entre structure et fonction sera donc réalisée dans des systèmes d’expression hétérologue. Nous utiliserons une analyse mutationnelle (P4), ainsi qu’une analyse biophysique grâce à l’utilisation de toxines de haute affinité (P2). Des études fonctionnelles (enregistrements par microélectrode et patch clamp) dans les cellules isolées et des préparations multicellulaires de tissus ex vivo identifieront les canaux K+ spécifiques qui ont un rôle clé dans la repolarisation cardiaque (P1, EU1), dans la transmission synaptique et la plasticité au sein du système nerveux central (P3, 6). Une analyse moléculaire permettra de corréler les observations fonctionnelles avec le niveau d’expression des canaux (P4).
Sujet 2 : Activité électrique spontanée normale et anormale.
La recherche se focalisera sur les canaux qui sont impliqués dans la dépolarisation membranaire spontanée, au premier chef les canaux HCN et, dans une moindre mesure, également les canaux Na+ voltage-dépendant et Ca2+ de type T. Différentes isoformes de ces canaux sont exprimés dans le cerveau et dans le cœur de manière physiologique, mais aussi de manière modifiée en cas de processus pathologique. Un objectif clé de ce projet est la recherche de ligands puissants et spécifiques à partir d’une grande librairie existante de peptides issus de venins naturels et dérivés de ceux-ci (P2). Certains objectifs spécifiques sont les suivants :
1. comparer le profil pharmacologique des canaux HCN de type 1-4 exprimés dans des oocytes de Xenopus laevis par rapport à des cellules de mammifères (HEK, CHO) (P2, P4)
2. étudier en profondeur les propriétés biophysiques de ces canaux HCN1-4 (particulièrement les propriétés de « gating ») (P4)
3. fournir des toxines à divers partenaires pour des études fonctionnelles dans des tissus ou des cellules naturelles : les neurones dopaminergique (P3), les neurones de ganglion dorsal (P4), les récepteurs de la glycine (P6). En outre, nous évaluerons l’expression différentielle des canaux de type HCN durant le remodelage cardiaque (P1, P3, P4).
Sujet 3 : Homéostasie du Ca2+ et feedback de celle-ci sur l’excitabilité membranaire
Dans ce projet, nous analyserons les altérations de l’homéostasie du Ca2+, ainsi que l’influence de ces altérations sur l’excitabilité membranaire dans le processus du remodelage, soit dans le contexte d’une hypertrophie cardiaque (P1, EU1). Les objectifs spécifiques sont d’examiner les altérations de la libération de Ca2+ et le rétrocontrôle de celles-ci sur l’excitabilité membranaire des cellules cardiaques, en particulier la modulation dépendant du Ca2+ des canaux Ca2+ , des propriétés de l’échangeur Na/Ca, de la capacité de générer des post-dépolarisations précoces ou retardées. Le potentiel de modulation pharmacologique sera également examiné. P6 fournira un système d’imagerie confocale rapide en 2 dimensions.
Sujet 4 : Communication cellulaire
Dans ce WP, nous aborderons certains aspects moins étudiés et novateurs de la communication intercellulaire au sein du système nerveux central. Nous examinerons comment des canaux connus pour réguler l'excitabilité neuronale (tels les canaux Ih et SK) peuvent influencer la plasticité synaptique (P3). Nous étudierons la communication neurono-gliale basée sur un système transmetteur-récepteur (P6) et la communication entre cellules non-neuronales du système nerveux impliquant les signaux calciques, via notamment les jonctions communicantes et les hemi-canaux (P5). Le but poursuivi par ce WP est d'établir le rôle de ces mécanismes dans la communication nerveuse et la plasticité synaptique.
Sujet 5 : Remodelage des canaux ioniques, plasticité et excitabilité membranaire
Ce programme intégrera des expériences sur la fonction des canaux, l’expression des différentes sous-unités, ainsi que leur phosphorylation. Il examinera des modifications intrinsèques à des altérations à long terme de la plasticité synaptique et du remodelage cardiaque. Les objectifs spécifiques sont d’établir le profil spatial de base de l’expression et de la distribution de différents canaux ioniques dans les neurones dopaminergiques (P3, EU2), d’évaluer la plasticité de ce profil dans les neurones dopaminergiques (P3, P4), d’évaluer la plasticité de l’expression, de la composition en sous-unités et de la phosphorylation de canaux Ca2+ dans la maladie ischémique chronique du cœur (P1, P4), d’évaluer le rôle de mécanismes dépendants du NO dans la modulation de canaux Ca2+ lors d’une fibrillation auriculaire chronique, et enfin d’examiner la plasticité des tubules T en tant que mécanisme potentiel de modulation de l’activité des canaux Ca2+ (P1, P4).
