Onderzoeksproject P6/31 (Onderzoeksactie P6)
Electrische exciteerbaarheid is hét kenmerk van primaire vitale organen zoals de hersenen en het hart. Transiënte veranderingen in de electrische potentiaal over het cel membraan zijn het resultaat van een sterk gecoördineerde aktiviteit van ionen kanalen en transporters. Deze electrische signalen transporteren informatie over grote afstand en initiëren complexe gebeurtenissen zoals geheugen, leerprocessen en hartspiercontractie; ze zijn ook de basis van de spontane ritmische activiteit in de hersenen en het hart. Dysfunctie van ionen kanalen is verantwoordelijk voor verschillende belangrijke aangeboren en verworven ziektebeelden, zoals hartfalen en verschillende neuronale aandoeningen. Voor aangeboren aandoeningen die het resultaat zijn van specifieke mutaties wordt vaak de term ‘channelopathies’ gebruikt.
De grote diversiteit in electrische signalen in het CZS en in de verschillende regios van het hart is het resultaat van de expressie van verschillende ionen kanalen, inclusief ionotrope receptoren en transporters in elke cel. Individuele ionenkanalen zijn transmembranaire proteïnen die bestaan uit verschillende subeenheden; regulatorische proteïnen zoals kinases en fosfatases zijn vaak geassocieerd met deze kanalen om op die manier grote proteïne-complexen te vormen. In het membraan kunnen ionen kanaal complexen verder georganiseerd zijn in specifieke subdomeinen zoals caveolae en lipid rafts; deze organisatie moduleert eveneens hun functie.
Inzicht in het proces van normale exciteerbaarheid in het hart en CZS vereist een kennis van de eigenschappen van ionen kanalen, hun structuur-functie relatie, co-assemblage, transport naar en integratie in het membraan en ‘turnover’. Het ontwarren van de mechanismen van ziekten met abnormale exciteerbaarheid hangt af van de kennis van deze eigenschappen en de beschikbaarheid van hulpmiddelen om de specifieke veranderingen in de functie van ionen kanalen te onderzoeken en te beschrijven. Meer zelfs, het inzicht in deze eigenschappen en in de mechanismen van dysfunctie voorziet ons van een rationele basis voor therapeutische ontwikkelingen.
Tegen deze achtergrond presenteert het consortium een gezamenlijk programma om op weefsel, cellulair en moleculair niveau, de functie en regulatie van verschillende ionen kanalen, transporters en ionotrope receptoren die verantwoordelijk zijn voor de normale en abnormale exciteerbaarheid in het hart en CZS te bestuderen. Een aantal gezamenlijke en geconserveerde eigenschappen van deze moleculen in verschillende types exciteerbare cellen rechtvaardigen en vergemakkelijken het gebruik van gemeenschappelijke platformen en kennis, terwijl de unieke functie in verschillende weefsels de uitwisseling en samenwerking tussen de verschillende partners verrijkt.
De deelnemende labo’s zijn experten in specifieke aspecten van exciteerbaarheid, ionen kanalen en ion transporters in gezond en ziek weefsel: structuur-functie relaties van kanalen en hun complexen (UA, D. Snyders), cardiale exciteerbaarheid en ‘remodeling’ door ziektes (KUL, K. Sipido), modulatie van ion kanaal activiteit door specifieke liganden (KUL, J. Tytgat), fysiologie en farmacologie van CZS ionen kanalen (Ulg, V. Seutin), inhiberende ionotrope receptoren (Uhasselt, J.M. Rigo). Tot dusver was de samenwerking tussen de partners sporadisch en niet gestructureerd. Zowel vanuit het wetenschappelijk standpunt als vanuit het organizatorisch standpunt binnen de Belgisch onderzoeksgemeenschap, biedt dit consortium een duidelijke meerwaarde. De opname van twee expert Europese labo’s (Universiteit Utrecht, M. Vos, cardiale electrofysiology; Universiteit van Bristol, N. Marrion, synaptische transmissie in het CZS) verhoogt verder het potentieel van dit netwerk. Via het IAP zal het consortium vraagstellingen aankaarten die het potentieel van individuele labo’s overstijgt.
Specifieke doelstellingen voor de samenwerking zijn:
o Oprichting van gemeenschappelijke technologie platformen
Gemeenschappelijk gebruik van grote toestellen (sequencer-confocale microscopie, inclusief live cell imaging − brain slice opname) en moleculaire hulpmiddelen (cloneren – mutaties – in vitro expressie in verschillende cel types); er wordt ook bijkomend specifieke technologie ontwikkeld binnen het netwerk.
o Combineren van onderzoeken op meerdere niveaus
Van in vivo electrofysiologie, tot weefsel electrofysiologie, cellulaire opnames en moleculaire analyse; complementaire studies en uitwisseling van data en materiaal; normale en abnormale functie in diermodellen (transgene muizen, grote diermodellen voor hart ziekten).
o Uitwisseling van expertise en kennis
Om het mogelijk te maken grotere onderzoeksvragen aan te kaarten; uitwisseling van materiaal, methoden van bestuderen; uitwisseling van postdoctorale onderzoekers; programma’s over het netwerk voor doctoraatsstudenten.
De onderzoeksactiviteiten zijn georganiseerd in werk pakketten (WP) gecentreerd op grote deelaspecten van exciteerbaarheid. Elk WP kaart specifieke onderzoeksdoelstellingen aan:
• ophelderen van de moleculaire architectuur en farmacologie van K+ kanalen en hun rol in exciteerbaarheid
• bestuderen en vergelijken van mechanismen van normale en abnormale ‘pacemaking’
• karakteriseren van de feedback van secundaire veranderingen in [Ca2+]i op membraan exciteerbaarheid
• bestuderen van eigenschappen van ionen kanalen en ionotrope receptoren in cel-tot-cel communicatie
• nagaan van de plasticiteit van ion kanaal expressie en functie in normale en pathogene condities
WP1. Moleculaire architectuur van K+ kanalen en hun rol in membraan exciteerbaarheid
Doordat de aktiviteit van K+ kanalen bepaald is door hun moleculaire architectuur welke bestaat uit subeenheid samenstelling, co-assemblage met β-subeenheden en secundaire modificaties, zal de structuur-functie analyse uitgevoerd worden in heterologe expressie systemen. We zullen mutatie analyse (P4) en interactie met specifieke toxines (P2) nagaan. Functionele studies (microelectrode en patch clamp opnames) in geïsoleerde cellen en multicellulaire preparaten van natief weefsel zullen specifieke ionen kanalen identificeren die een sleutelrol hebben in cardiale repolarisatie (P1, EU1), in synaptische transmissie en plasticiteit in het CZS (P3,7); moleculaire analyse correleert functionele observaties en kanaal expressie (P5).
WP2. Normale en abnormale pacemaker aktiviteit
Dit WP zal zich richten op kanalen die betrokken zijn bij spontane membraan depolarisatie, voornamelijk HCN kanalen, en in mindere mate ook op Nav en T-type Ca kanalen. Deze kanalen komen tot expressie met verschillende isovormen in de hersenen en in het hart; ze maken deel uit van de normale cel functie, maar ook van ziekteprocessen. Centraal in het WP is het zoeken naar krachtige en specifieke liganden beginnende met de uitgebreide bestaande bibliotheek van natuurlijke giffen en gif-afgeleide peptiden (P2). Sommige specifieke doelstellingen bestaan uit het vergelijken van het farmacologisch profiel van HCN1-4 kanalen geëxprimeerd in Xenopus laevis oocyten versus zoogdier cellen (HEK, CHO) (P2,P4); het grondig bestuderen van de biofysische eigenschappen van HCN1-4 (vooral het ‘gating’ gedrag) (P4); het beschikbaar stellen van toxines voor de partners voor functionele studies in natieve weefsels: dopaminerge neuronen (P3), dorsal root ganglion (DRG) cellen (P4), glycine receptoren (P6). Bijkomend zullen we de verschillende expressies van HCN kanalen gedurende ‘remodeling’ evalueren (P1, P4).
WP3. Calcium homeostase en respons op membraan exciteerbaarheid
In dit WP analyseren we veranderingen in calcium homeostase en de respons op membraan exciteerbaarheid tijdens processen van ‘remodeling’, met hypertrofie (P1, EU1). Specifieke doelen zijn het onderzoeken van de veranderingen in Ca2+ afgave en respons op membraan exciteerbaarheid in hartcellen, voornamelijk Ca2+-afhankelijke verandering van Ca2+ kanalen, eigenschappen van de Na/Ca exchanger, induceerbaarheid van vroege en uitgestelde na-depolarisaties en mogelijkheid tot farmacologische verandering. P6 zal een snelle 2D confocale beeldvorming voorzien.
WP4. Cel-naar-cel communicatie
In dit WP onderzoeken we minder bekende en nieuwe mechanismen van cel-cel communicatie in het centrale zenuwstelsel. We onderzoeken hoe ionenkanalen die neuronale exciteerbaarheid reguleren, Ih en SK, een rol spelen in synaptische plasticiteit (P3). We onderzoeken communicatie tussen neuronen en glia cellen op transmitter/receptor basis (P6) en communicatie tussen glia cellen onderling en met ander non-neuronale cellen via Ca2+ signalen, met focus op de gap-junctions en hemikanalen (P5). Het doel van dit WP is de rol van deze mechanismen te onderzoeken in synaptische communicatie en plasticiteit.
WP5. Modulatie, plasticiteit en membraan exciteerbaarheid van ionkanalen
Dit WP zal gegevens over kanaalfuncties, expressie van verschillende subeenheden en fosforylatie integreren en veranderingen inherent aan langdurige wijzigingen in synaptische plasticiteit en in ‘remodeling’ onderzoeken. Specifieke doelen zijn het nagaan van het spatiële profiel van ionkanaal expressie en distributie in de dopaminerge neuronen (P3, EU2); het evalueren van de plasticiteit van distributie in DA neuronen (P3, P4); het evalueren van de plasticiteit in expressie, subeenheid samenstelling en fosforylatie van het Ca2+ kanaal in chronisch ischemisch hartlijden (P1, P4); evalueren van de rol van NO-afhankelijke mechanismen in vergelijking met veranderingen in expressie van verschillende subeenheden in de modulatie van het Ca2+ kanaal in chronisch atriale fibrillatie; het onderzoeken van de plasticiteit van T-tubules als een mechanisme voor de modulatie van Ca2+ kanaal activiteit (P1, P4).
