Onderzoeksproject P6/41 (Onderzoeksactie P6)
Behandeling van infectie door het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) heeft de morbiditeit en mortaliteit van het verworven immunodeficiëntiesyndroom (AIDS) tijdens de laatste jaren verminderd, maar resistentie aan de bestaande medicatie is een toenemend probleem. Nieuwe strategieën zijn nodig om het HIV op verschillende manieren aan te pakken om escape aan de behandeling te voorkomen. Om dit te bereiken, dient fundamenteel onderzoek verricht te worden om de medicatie, die gericht is tegen “klassieke” virale enzymen, efficiënter te gebruiken, maar ook dient er gezocht worden naar nieuwe targets, gebruikmakend van moleculair-biologische en immunologische benaderingswijzen.
Wij zullen onderzoek verrichten naar de mogelijkheid om de HIV-replicatie te inhiberen door gebruik te maken van de volgende strategieën:
1. Ontwikkeling van geavanceerde bio-informatica om virale escape onder medicatie- en immune druk te voorspellen en tegen te gaan.
2. Vinden van nieuwe drugtargets, die niet zouden lijden aan kruisresistentie voor de huidige drugs.
3. Verfijning van de RNA-interferentie (RNAi)-technologie om escape te voorkomen.
4. De mogelijkheid van “autologe” immunotherapie onderzoeken, gebaseerd op transfectie van dendritische cellen (DC) en andere antigenpresenterende cellen (APC) met HIV-afgeleid boodschapper RNA (mRNA).
5. Ontwikkeling van een geschikt klein diermodel om deze nieuwe benaderingen in vivo uit te testen.
In het huidige voorstel, zullen wij niet nieuwe behandelingen in de kliniek uittesten, maar zullen wij het basisonderzoek uitvoeren, gebruikmakend van een multidisciplinaire benadering.
1. De ontwikkeling van bio-informatica om de huidige drugs doelmatiger te gebruiken
De huidige richtlijnen bevelen aan dat men de virale protease en reverse transcriptase (enzymen die het doelwit zijn van de huidige medicatie) zou genotyperen, vooraleer men een therapeutische beslissing neemt. Toch, dient de genotypische interpretatie van drugresistentie verbeterd te worden. Partner Vandamme is bezig met het continu bijwerken van het veelgebruikt Rega-algoritme, dat door haar groep ontwikkeld is. Binnen dit project, zal een grote informatiedatabase over behandeling van patiënten en drugresistentie (heden meer dan 23000 patiënten) gevoegd worden aan data over virusevolutie, gebruikmakend van “datamining” and modellering, zodat een bio-informatica instrument ontwikkeld wordt. Deze bio-informatica zal dan niet alleen voor een individuele patiënt kunnen interpreteren wat de actuele drugresistentie is, maar ook hoe ze zal evolueren tov de volgende behandelingslijn. Bovendien, zal zulk een bio-informatica het mogelijk maken om resistentie-paden in kaart te brengen, die dan kunnen bevestigd worden door klassieke in vitro moleculair-biologische technieken (in vitro mutagenese, genotypering, fenotypering). Deze benadering is volledig nieuw en voorlopige gegevens wijzen erop dat het concept bruikbaar is. Dit geïntegreerd fundamenteel onderzoek naar virale evolutie onder selectieve druk van medicatie verschaft een model om gelijkaardige, meer uitgebreide bio-informatica te ontwikkelen die virale escape onder selectieve druk van het immuun stelsel te voorspellen en te voorkomen. Ontwikkeling op dat gebied zal van nut zijn voor toekomstige immunotherapeutische strategieën (zie partners Vanham and Berneman).
2. Nef als nieuw therapeutisch doelwit
Virus-celinteracties zijn interessante drugtargets, gezien men op dat gebied minder drugresistentie verwacht, omdat interactiesites van virale en cellulaire eiwitten hoogstwaarschijnlijk geconserveerd zullen zijn. Het HIV-1 Nef-eiwit speelt een belangrijke rol in de ziekte-ontwikkeling naar AIDS. In vitro, schijnt Nef niet noodzakelijk te zijn voor virusreplicatie, maar patiënten geïnfecteerd met virus zonder Nef vertonen een veel tragere evolutie naar AIDS. Nef zou dus een interessant doelwit kunnen zijn om ziekteprogressie te vertragen. Nef interfereert met de differentiatie van T lymfocyten door een interactie met domeinen die belangrijk zijn voor T celreceptorsignalen. Recente bevindingen wijzen erop dat CD4, major histocompatibility complex (MHC) klasse I en CD8 geïnternaliseerd worden door Nef. Partner Verhasselt zal de mechanismen onderzoeken, waardoor Nef T celontwikkeling verstoort en met de functie van DC en T cellen interfereert (samen met partners Berneman and Vanham). Een “toegewijde” RNAi-technologie zal ontwikkeld worden samen met partner Berkhout. Een bijkomende nadruk zal gelegd worden op het verband tussen Nef-sequenties van primaire isolaten en van hun functie (er zal een link gelegd worden met de datamining-technieken van partner Vandamme). Data hieromtrent zijn van fundamenteel belang om te bepalen welke interacties tussen Nef en cellulaire eiwitten het doelwit zouden moeten zijn van antivirale therapie.
3. RNAi als nieuw therapeutisch doelwit
Partner Berkhout toonde recent aan dat RNA-interferentie (RNAi) in staat is om HIV-1-replicatie in vitro te onderdrukken. Hij ontwikkelt nu een lentiviraal gentherapiesysteem, waarvan verwacht wordt dat het HIV-gevoelige cellen beschermt tegen HIV, door expressie van multipele “short-interfering RNAs” (siRNAs) gericht tegen het virale RNA-genoom. Krachtige inhibitie door sommige siRNAs werd aangetoond, maar eveneens werd virus-escape gezien, ten gevolge van mutatie van de targetsequentie of door andere mechanismen. Om virale escape te voorkomen, is het de bedoeling van partner Berkhout om in dit project een multi-siRNA-benadering te volgen, gelijkaardig aan de combinatietherapie van antivirale drugs in “highly active anti-retroviral therapy” (HAART). Met deze gentherapie, is het de bedoeling om een langtermijn verbetering aan te brengen in de conditie van HIV-1-geïnfecteerde patiënten, in het bijzonder van deze die niet meer kunnen behandeld worden met antivirale drugs tgv resistentie of drugtoxiciteit. HIV-1-geïnfecteerde patiënten in Nederland zijn vnl. inheemse mannen, die geïnfecteerd zijn met HIV-1 subtype B stammen, maar de diagnose van infectie met HIV-1 subtype C wordt in een vlug toenemend aantal van immigrerende vrouwen en mannen gesteld. Alle HIV-1 subtypes zijn potentieel vatbaar voor de voorgestelde gentherapiebenadering. In dit preklinisch project, zal het effect van de verschillende RNAi-benaderingen bestudeerd worden, o.m. op de virale escapemogelijkheden. Partner Berkhout zal ook proberen cellulaire factoren te onderdrukken, die van kritisch belang zijn voor virusreplicatie of waarvan aangetoond wordt door de research van partner Verhasselt dat ze interageren met Nef. In samenwerking met partners Vanham en Berneman, zal de RNAi-benadering ook toegepast om de “suppressor of cytokine signaling (SOCS)” pathway te inhiberen om te proberen HIV-antigenpresentatie te verbeteren.
4. Immunotherapie als een nieuwe therapeutische strategie
Immunotherapie heeft de bedoeling om de immuniteit tegen HIV te versterken en virale replicatie, evolutie en escape te voorkomen. Partners Vanham en Berneman zijn de basis aan het leggen voor een nieuwe therapeutische volledig autologe vaccinatie met monocyt-afgeleide DC (MO-DC) en mRNA coderend voor HIV-eiwitten. Recent toonden ze aan dat het mogelijk is om plasmavirale en cellulaire provirale autologe HIV-sequenties van individuele patiënten te vermeerderen, over te schrijven naar mRNA en te gebruiken om MO-DC op te laden en autologe CD4+ and CD8+ T cellen specifiek te stimuleren. In het voorgestelde project zullen DC opgeladen worden met proviraal-afgeleide mRNA van HIV-1-geïnfecteerde patiënten; een vergelijking zal uitgevoerd worden met DC opgeladen met mRNA afgeleid van consensus-sequenties. De capaciteit van de aldus behandelde DC om T celresponsen met protectief potentiaal te induceren zal onderzocht worden, gebruikmakend van een combinatie van in vitro methoden. Secundaire responsen zullen nagegaan worden in DC/T celkweken van patiënten met lage tot niet-detecteerbare virale lading, ofwel van “long term non-progressors (LTNP)” ofwel van patiënten onder HAART. Voortbouwend op de bevindingen die gemaakt werden met MO-DC, die klassiek gekweekt werden in medium met granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) + interleukin (IL)-4, zal partner Berneman (in nauwe samenwerking met partner Vanham) onderzoeken of verandering van de DC differentiatie- en/of maturatie-inducerende factoren en toevoeging van structurele en regulerende HIV-sequenties (als antigenen) zullen leiden tot een verbetering in HIV-1-specifieke T celresponsen ex vivo. De bedoeling is het verkrijgen van efficiënte CD4+ and CD8+ geheugen (“memory”) responsen tegen HIV, om virale “rebound” and escape te voorkomen. Ten slotte, hopen wij dat dat optimalisatie van de APC-functie zal toelaten om primaire in vitro responsen (in perifeer bloedlymfocyten (PBL) van seronegatieve individu’s) te genereren, en op die manier ook te kunnen bijdragen tot vooruitgang op gebied van preventieve HIV vaccinatie.
5. Een in vivo HIV muismodel
Binnen het project, zullen wij dan een stap zetten van de in vitro infecties en celkweekcondities naar een nieuw in vivo muismodel voor HIV. Partner Moutschen zal een Trimera muismodel ontwikkelen, waarbij een betere enting (“engraftment”) en overleving optreedt van menselijke PBL dan in de klassieke NOD/SCID muizen. Trimera muizen zijn ook makkelijker te hanteren voor reconstitutie door PBL van geïnfecteerde patiënten en voor daaropvolgende (immune) therapeutische studies. Eerst, zal de kinetiek van HIV-replicatie bestudeerd worden, na complementeren van de muizen met PBL van LTNP en van patiënten onder HAART. In een volgende stap, zal de in vivo antivirale activiteit van adoptief getransfereerde T cellijnen, in vitro gegenereerd van deze patiënten door partner Vanham. In aansluiting, zal de profylactische efficiëntie van APC-gebaseerde vaccins (ontwikkeld door partner Berneman) geëvalueerd worden in Trimera muizen, behandeld met normale PBL and onderzocht op immuniteit voor HIV na vaccinatie. Ten slotte, zal de therapeutische doelmatigheid van APC-gebaseerde vaccins bestudeerd worden in muizen behandeld met PBL van HIV-geïnfecteerde donoren. Deze experimenten zullen een “proof-of-concept” bewijs leveren voor het verdere gebruik van dit model in therapeutische trials met nieuwe agentia, RNAi inbegrepen (partner Berkhout).
