Projet de recherche P7/10 (Action de recherche P7)
Cadre de la recherche et objectifs généraux
Nous connaissons une augmentation importante de l’espérance de vie dans nos sociétés occidentales en raison de progrès dans les traitements médicaux et dans nos conditions de vie, ainsi que suite à l’amélioration de notre style de vie et à la mise en place de mesures préventives. En Europe, les défis en matière de santé sont dominés par la problématique du vieillissement de la population. Concernant le nombre de personnes malades et de l’impact sur la santé, les maladies cardiovasculaires sont en tête des causes de mortalité, tandis que les maladies du système nerveux central (SNC) sont parmi les principales causes de morbidité dans le monde (Anderson & Chu, NEJM 2007). Pour affronter ces défis une approche multidisciplinaire large est requise, alliant la recherche clinique et fondamentale ou traversant les frontières traditionnelles entre domaines. Le présent projet rassemble des équipes aux expertises et perspectives diverses, mais partageant un intérêt commun pour l’étude de la signalisation électrique et l’excitabilité, de leurs mécanismes fondamentaux jusqu’à leur traduction clinique.
La signalisation électrique par potentiels d’action constitue la caractéristique des tissus excitables, à savoir le SNC, le cœur, le muscle strié volontaire ainsi que certains organes endocriniens tels que le pancréas. Les potentiels d’action déclenchent des signaux biologiques complexes qui incluent des réponses à court terme, telles que le couplage excitation-contraction dans les cardiomyocytes, ainsi que des réponses à long terme comme la plasticité synaptique et la mémoire dans le SNC ou des signaux de croissance cellulaire dans le cœur. Les potentiels d’action sont générés grâce à une activité concertée de canaux ioniques à partir d’une différence de potentiel transmembranaire au repos qui est négative. Les canaux ioniques forment une super-famille très vaste et complexe de protéines transmembranaires qui sont exprimées dans divers tissus. La spécificité tissulaire et cellulaire est obtenue par des différences dans les niveaux d’expression, une expression différentielle d’isoformes et l’organisation en complexes macromoléculaires.
L’objectif global de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes spécifiques d’excitabilité électrique dans le cœur et le SNC. Il est centré sur l’étude des mécanismes moléculaires complexes, tout en s’étendant à leur implication dans la physiologie cellulaire, ainsi que dans des phénomènes physiologiques et physiopathologiques intégrés in vivo. Ces approches sont complétées par de la modélisation. Les laboratoires participants ont une expertise approfondie dans différents aspects de l’excitabilité, des canaux ioniques et des transporteurs dans le tissu normal et pathologique : relation structure-activité des canaux et de leurs complexes (P4), excitabilité cardiaque et remodelage dû à la maladie (P1), modulation de l’activité des canaux par des ligands spécifiques (P2), physiologie et pharmacologie des canaux du SNC (P3), communication intercellulaire et hémicanaux (P4), récepteurs ionotropiques inhibiteurs et canaux de la glie (P5), plasticité synaptique et activité de réseaux dans le SNC (P6), modélisation de l’excitabilité et de l’arythmie cardiaque (A. Panfilov, P4). L’inclusion de laboratoires européens nous permet d’accroître notre expertise dans les mécanismes intégrés (INT1) des arythmies, ainsi que dans le domaine de l’ischémie cardiaque (INT3) et de la transmission synaptique dans le SNC (INT2).
A différents niveaux, nous souhaitons initier des approches translationnelles qui explorent, soit le potentiel diagnostique, soit la validité de cibles thérapeutiques. Le fait de couvrir les domaines cardiaque et nerveux a déjà démontré sa valeur ajoutée : depuis la création de notre réseau, nous avons, au cours des quatre dernières années, initié des études conjointes sur des canaux ioniques qui avaient été initialement étudiés dans un tissu, mais qui se sont révélés avoir des fonctions spécifiques dans d’autres. C’est le cas des hemicanaux de connexines (P4, P1) et des canaux SK (P3, INT2,P1, P5). Des échanges de jeunes scientifiques à travers le réseau génèrent une large plateforme d’apprentissage, tandis que des activités conjointes augmentent la visibilité de l’approche multidisciplinaire. Nous avons ajouté au consortium initial des partenaires belges pour renforcer le réseau avec une expertise transgénique (P6) et de modélisation (A. Panfilov chez P4), ainsi que des partenaires étrangers. Les objectifs du réseau restent centrés sur des programmes de recherche communs, des échanges de techniques, des outils communs et l’apprentissage de jeunes scientifiques. Il cherche à atteindre une meilleure communication et un impact plus importants. Les objectifs de notre recherche sont déclinés en 5 thématiques (workpackages, WP).
Plan de recherche
WP1 : architecture moléculaire des canaux ioniques, complexes macromoléculaires et interactions entre canaux.
Dans ce WP, nous étudierons les propriétés moléculaires de canaux ioniques, y compris le niveau récemment reconnu des complexes macromoléculaires, ainsi que des différents compartiments membranaires. Deux projets y seront consacrés : l’un se centre sur les modulateurs de canaux et leur interaction avec le canal à travers une analyse de relation structure-fonction ; l’autre étudie des complexes de différentes sous-unités et des assemblages multiprotéiques.
Les canaux K+ sont étudiés au niveau de la tétramérisation des sous-unités, du co-assemblage avec des sous-unités et de modifications secondaires. L’analyse de la relation structure-fonction inclut de l’utilisation de toxines puissantes (P2) et de l’imagerie moléculaire sophistiquée (FRET, imagerie par spectroscopie de corrélation et l’imagerie de protéines isolées (collab D. Snyders, UA , P5), ainsi que des études fonctionnelles (enregistrements intracellulaires et de patch clamp) . La priorité se situera au niveau de canaux spécifiques du pacemaking (P2, INT2), et de la transmission synaptique et de la plasticité dans le SNC (P3, P6).
Les hémicanaux de connexines seront étudiés pour identifier les régions qui confèrent la dépendance à l’égard du voltage et la possibilité pour le calcium de contrôler leur activation. Un type de canal de libération du calcium à partir des réservoirs intracellulaires, aussi appelé récepteur de la ryanodine, RyR, fonctionne en tant que macrocomplexe multiprotéique . En outre, il est contrôlé par d’autres canaux ioniques qui lui sont associés. La structure et l’organisation de ce complexe dans les cellules normales ou pathologiques seront étudiées en utilisant de l’imagerie moléculaire sophistiquée incluant le STED (P1) et la détermination des canaux et protéines en interaction avec le RyR, et ce par des techniques moléculaires.
En ce qui concerne les récepteurs de la glycine, GlyR, leur niveau d’agrégation de même que leurs interactions avec d’autres protéines (sous)membranaires détermine leur localisation (synaptique ou extra-synaptique) et certains aspects de leur comportement dynamique.
WP2 : Mécanismes de l’activité « pacemaker » normale et pathologique.
Dans le cœur et le SNC, certains types cellulaires génèrent une activité électrique spontanée : on les appelle « cellules pacemaker ». Plusieurs types de canaux (HCN, canaux calciques, canaux sodiques, transporteurs de calcium, …) contribuent à l’activité pacemaker dans les conditions normales, ce qui permet la robustesse de celle-ci, et ce de manière variable selon les cellules considérées. Dans ce WP, nous nous focaliserons sur le SNC. En effet, il existe des arguments de plus en plus convaincants pour dire que des altérations de l’activité « pacemaker » contribuent à la physiopathologie de certaines maladies. Un premier projet sera consacré aux mécanismes qui sous-tendent l’activité de cellules « pacemaker » dites lentes (P3, P6). A l’aide d’expériences fonctionnelles et de simulations, nous déterminerons si la coopération entre les canaux calciques de types L et les canaux sodiques qui ont été caractérisés par P3 dans les neurones dopaminergiques, contribue à l’activité « pacemaker » de manière semblable dans toutes les sous-populations de ces neurones. L’inactivation conditionnelle du gène codant pour certains canaux ioniques grâce à l’utilisation de souris « DAT-CRE » de la technologie des sh RNA, permettra de corréler l’activité neuronale et le comportement (P6). Un deuxième projet sera consacré aux GABA-dependent fast-spiking interneurones qui sont régulés par les neurones dopaminergiques. L’objectif est de déterminer si leur activité dépend des oscillations du réseau ou est indépendant. Cette question sera explorée dans des études fonctionnelles (P6), à l’aide de toxines purifiées (P2) qui peuvent bloquer très spécifiquement ces canaux, ainsi qu’en corrélant la fonction et l’expression moléculaire.
WP3 : Lien entre l’homéostasie calcique et l’excitabilité électrique
Beaucoup de canaux ioniques des cellules excitables participent au controle de la concentration intracellulaire de calcium ([Ca2+]i), mais sont également contrôlés par [Ca2+]i, ce qui établit un lien étroit entre Ca2+ et excitabilité. Dans ce WP, nous étudierons certains canaux spécifiques et utiliserons également une approche plus intégrative.
Les hémicanaux à base de connexines forment un pore transmembranaire non sélectif, qui est modulé par [Ca2+]i, mais qui est également perméable aux ions Ca2+ et peut contribuer à des oscillations de Ca2+. Des résultats préliminaires (P4, P1) indiquent leur présence dans le cœur et suggèrent une moindre activation dépendante du voltage dans les conditions où [Ca2+]i est augmenté. Nous caractériserons de manière plus fine les conditions d’activation de ces canaux dans les cardiomyocytes. Des études fonctionnelles de canaux isolés , utilisant des peptides spécifiques (P1, P4), seront complétées par de la modélisation (A. Panfilov, P4). Le rôle de l’organisation des RyR dans le controle de [Ca2+]i et son rétrocontrôle sur l’excitabilité membranaire seront étudiés à l’aide d’imagerie calcique confocale et de FRET. Nous étudierons aussi le rôle de Ca2+ dans la labilité de la repolarisation dans des cellules intactes, ainsi que sa contribution à des marqueurs fonctionnels prédictifs d’une arythmie (P1, INT1). Des modèles d’arythmies sur grands animaux seront centraux dans ce projet.
WP4 : Rôles des canaux ioniques activés par des ligands dans la plasticité de l’excitabilité
Dans ce WP, nous étudierons le rôle de ces canaux dans la plasticité qui existe lors du développement du SNC, ainsi qu’à l’âge adulte en conditions normales et pathologiques.
Nous étudierons le rôle des canaux ligand-dépendants inhibiteurs, plus spécialement les GlyR, dans la prolifération et la migration des neurones de projection et des interneurones corticaux pendant le développement. Les méthodes utilisées seront l’imagerie calcique dynamique (« time-lapse »), le patch-clamp sur tranches, les shRNA et les reconstructions de la migration en 3D (P5, P6).
Nous étudierons l’influence de la sous-unité essentielle au fonctionnement du récepteur NMDA (NR1) sur l’excitabilité intrinsèque et l’activité de réseaux- transmission et plasticité synaptique – dans des sous-types spécifiques de neurones des ganglions de la base. Ceci se fera à l’aide de souris transgéniques conditionnelles (P4, P3). Nous déterminerons la corrélation de cette influence avec celle de ce récepteur sur l’activité motrice et le comportement motivationnel en conditions normales et pathologiques (addiction et maladie de Parkinson, P6).
WP5 : Nouvelles approches et nouveaux outils dans l’étude du rôle des canaux ioniques au niveau de l’excitabilité normale et pathologique
Plusieurs partenaires du réseau participent au développement de modulateurs spécifiques de canaux, tels que des petits peptides synthétiques, des toxines dérivées de venin et des composés organiques. Nous utiliserons des neurones adultes de DRG en tant que modèles de « screening » de toxines de venin naturelles qui peuvent être utilisées comme « lead compounds » pour le développement de molécules neuroactives. Un « screening » sera opéré en parallèle sur des oocytes de Xenopus laevis et des lignées cellulaires transfectées grâce à l’utilisation d’un système de patch clamp automatisé qui a été acquis durant la phase précédente du PAI (P4, P5). Le but est de développer de nouveaux outils pharmacologiques dérivés de toxines, et en particulier d’évaluer le potentiel de Nav1.6 et des récepteurs P2X comme cibles thérapeutiques.
Une ouverture non contrôlée des hémicanaux formés par les connexines se produit en réponse à l’ischémie, aux cytokines pro-inflammatoires et à l’élévation de [Ca2+]i. Nous développerons de nouveaux outils pour déterminer si ces canaux ont un rôle arythmogène (INT3, P1, P4). Pour ce faire, nous disposons de petits peptides synthétiques qui inhibent les hémicanaux sans affecter la fonction des jonctions serrées (P4).
Enfin, nous explorerons l’intérêt d’intégrer dans un modèle computationnel le remodelage des canaux ioniques et les données morphologiques obtenues in vivo dans un modèle de fibrillation auriculaire chez le mouton, et ce afin d’identifier les étapes critiques de la progression de la maladie (Willems P1, Panfilov P4).
