Onderzoeksproject P7/10 (Onderzoeksactie P7)
Achtergrond en algemene objectieven
De vooruitgang op het vlak van behandeling van ziekten, de verbeterde levensomstandigheden en levensstijl alsook de implementatie van preventieve maatregelen hebben voor een sterk toegenomen levensverwachting gezorgd in de westerse wereld. De toenemende vergrijzing als gevolg hiervan is, in Europa en daarbuiten, een thema dat duidelijk de gezondheidsagenda bepaalt, niet in het minst door de financiële repercussies ervan. Cardiovasculaire aandoeningen en ziekten van het centraal zenuwstelsel (CZS) zijn koplopers wat betreft prevalentie en impact op de gezondheidszorg (Anderson & Chu, NEJM 2007). Om de voorstaande uitdagingen succesvol het hoofd te kunnen bieden is een brede multidisciplinaire aanpak noodzakelijk die zowel een klinische als fundamenteel-wetenschappelijke benadering inhoudt en die de klassieke aflijning van disciplines overstijgt. Het huidige projectvoorstel brengt verschillende onderzoeksgroepen samen met diverse expertises, aanpak en methodologische benaderingswijzen die zowel basismechanismen als translatie naar een klinische setting garanderen en die allen gefocusseerd worden op een beter begrip van de elektrische signalisatie en exciteerbaarheid van hart en CZS.
Exciteerbare weefsels zoals hart en CZS, alsook skeletspieren en sommige endocriene organen zoals de pancreas zijn gekenmerkt door elektrische signalisatie via actiepotentialen. Actiepotentialen veroorzaken complexe biologische signalen die zich zowel kunnen afspelen op een milliseconde tijdschaal, bijvoorbeeld excitatie-contractie koppeling in hartspiercellen, als op langere termijn (minuten, uren, dagen) zoals het geval is bij synaptische plasticiteit en geheugen in het CZS, of bij de effecten van groeisignaalmoleculen in het hart. Actiepotentialen worden gegenereerd door de geconcerteerde activiteit van ionenkanalen die zorgen voor een tijdelijke depolarisatie van de membraanpotentiaal die bij de cel in rust een negatieve waarde heeft (grootte-orde -50 tot -80 mV). De betrokken ionenkanalen vormen een uitgebreide en complexe superfamilie van membraanoverspannende eiwitten die in tal van organen, in het bijzonder in hart en CZS, terug te vinden zijn. De weefsel- en celspecificiteit worden bepaald door, onder andere, verschillen in de expressiegraad, de aanwezigheid van orgaan-specifieke isovormen en de organizatie als macro-moleculaire complexen.
Het doel van dit project is om te komen tot een beter inzicht in de specifieke mechanismen van elektrische exciteerbaarheid in het hart en CZS, met focus op zowel de complexe moleculaire mechanismen, de geassocieerde celfysiologische aspecten, als op de meer integratieve fysiologische en pathofysiologische aspecten in vivo, verder aangevuld met in silico modelering. De betrokken onderzoeksgroepen hebben een gegronde expertise in specifieke aspecten van exciteerbaarheid, ionenkanalen en ionentransporteiwitten, zowel wat betreft de functie onder normale omstandigheden als de verstoorde functie bij aandoeningen van hart en CZS. Meer bepaald wordt gefocusseerd op de structuur-functie relatie van ionenkanalen in de context van hun complexe associatie met omgevende eiwitpartners, de cardiale exciteerbaarheid en orgaanhermodelering bij hartziekten (P1), de modulatie van ionenkanalen door specifieke liganden (P2), de fysiologie en farmacologie van ionenkanalen in het CZS (P3), de intercellulaire communicatie via gap juncties en hemikanalen (P4), de inhibitorische ionotrope receptorkanalen en neurogliale ionenkanalen (P5), synaptische plasticiteit en netwerk activiteit in het CZS (P6), integratieve modelering van exciteerbaarheid en cardiale arrhythmieën (A. Panfilov P4). De inclusie van Europese partner laboratoria scherpt verder de expertise aan op het vlak van een meer integratieve benadering naar het orgaan in toto (INT1), alsook wat betreft ischemische hartaandoeningen (INT3) en synaptische transmissie in het CZS (INT2).
Op diverse niveaus wordt de link naar translationeel-relevante benaderingen uitgewerkt op het vlak van zowel diagnostische uitwerking als het vinden van nieuwe therapeutische targets. De combinatie van studies die zowel het hart als het CZS omvatten is vrij uniek en heeft een belangrijke toegevoegde waarde: sinds de start van het in 2011 aflopende IAP netwerk zijn er diverse samenwerkingen gesmeed die het mogelijk maken om kennis en inzichten verworven vanuit studies op één orgaan toe te passen op het andere orgaan, bijvoorbeeld op het vlak van de connexine hemikanalen (P4, P1) en de SK kanalen (P3, INT2, P1, P5). Verder genereert de uitwisseling van jonge wetenschappers tussen de diverse betrokken laboratoria een breed trainingsplatform die de samenwerking en multidisciplinaire benadering daadwerkelijk vorm geeft. Ten opzichte van het in 2011 aflopende IAP netwerk zijn in het voorliggende voorstel nieuwe expertise en invalshoeken toegevoegd, namelijk op het vlak van transgene diermodellen (P6), mathematische modelering (A. Panfilov at P4) en inbreng van buitenlandse laboratoria. De objectieven van het huidige consortium blijven gericht op het operationeel maken van een gemeenschappelijk onderzoeksprogramma, de uitwisseling van expertise, de toegang tot gemeenschappelijke methodieken en infrastructuur, de training van jonge veelbelovende wetenschappers en een streven naar optimale communicatie naar buiten toe. Het onderzoeksprogramma zit vervat in 5 werkpaketten.
Onderzoeksplan
WP1. Moleculaire architectuur van ionenkanalen, macrocomplexen en multi-kanaal interacties
In dit WP worden de moleculaire eigenschappen, inclusief de meer recente inzichten omtrent de macromoleculaire organisatie en de specifieke membraancompartimenten in twee grote programma’s bestudeerd. Één programma is gefocusseerd op kanaalmodulatoren en op het onderzoek van effecten van mutationele wijzigingen op de structuur-functie relatie; een tweede programma is gefocusseerd op de organisatie van verschillende subunits als macrocomplex en op multiproteïne assemblies.
K+ kanalen worden bestudeerd op het vlak van hun tetramere organisatie, hun co-assemblage met β-subunits en hun secondaire modificaties. Structuur-functie analyse omvat mutationele analyse en het testen van specifieke toxines (P2, collab D. Snyders, UA) en geavanceerde moleculaire beeldvorming (FRET, beeld correlatie spectroscopie, ‘single-particle tracking’, collab D. Snyders, UA, P5), gecombineerd met functionele studies (intracellulaire en patch clamp registraties) en moleculaire analyse (immunohistochemie, RNAi, qRT-PCR) (P4, INT4). De specifieke focus is gericht naar de rol van K+-kanalen in pacemaker (gangmaker) activiteit (P2, INT2), in synaptische transmissie en plasticiteit in het CZS (P3,4,7).
Connexine hemikanalen worden bestudeerd om een beter inzicht te krijgen in de eiwitdomeinen die instaan voor de koppeling tussen spanningsafhankelijkheid en kanaal ‘gating’, en die instaan voor de kanaal modulatie door veranderingen in cytoplasmatische Ca2+ concentratie ([Ca2+]i).
Het ryanodine-receptor (RyR) Ca2+-vrijstellingskanaal functioneert in de context van een multi-proteïne macrocomplex dat verder beïnvloed wordt door colocalisatie met andere ionenkanalen. De structuur en organisatie van dit complex in normale cellen en cellen onder pathologische omstandigheden worden bestudeerd met behulp van geavanceerde moleculaire beeldvormingstechnieken, onder meer door gestimuleerde emissie depletie (STED) microscopie (P1) en het detecteren van interagerende ionenkanalen en eiwitten door middel van moleculaire assays.
Voor glycine receptorkanalen (GlyR) zijn kanaal-clustering en interacties met (sub)membranaire eiwitten belangrijke determinanten van hun synaptische of extra-synaptische locatie alsook voor hun dynamische respons
WP2. Mechanismen van normale en abnormale pacemaking
In het hart en in het CZS wordt spontane elektrische activiteit gegenereerd door specifieke celtypes, meer bepaalde de zogenaamde ‘pacemaker’ cellen. Diverse kanalen (onder meer HCN kanalen, Ca2+ kanalen, Na+ kanalen) en transporteiwitten (Ca2+ transporters, …) dragen bij tot het ontstaan van deze pacemaker activiteit onder normale omstandigheden, wat zorgt voor een veiligheidsfactor; hun activiteit is aangepast aan de specifieke cellen waarin deze operationeel zijn. In dit WP wordt gefocusseerd op pacemaking in het CZS, gebaseerd op een groeiende evidentie dat veranderingen in pacemaker activiteit een essentieel onderdeel zijn van de pathologische cascade van CZS aandoeningen.
Een eerste programma focusseert op mechanismen van zogenaamde ‘slow’ pacemakers (P3,P6). Meer bepaald gaan we door middel van functionele en in silico experimenten nagaan of coöperatieve effecten tussen L-type Ca2+ kanalen en Na+ kanalen, die gekarakteriseerd zijn geworden door P3 in dopaminerge neuronen, de pacemaking eigenschappen beïnvloeden. Conditionele gen-inactivatie studies (P6) van sleuteleiwitten die de kanaalfunctie beïnvloeden (gebruik makende van Cre-specifieke muizen (DAT-Cre of ChAT-Cre) alsook het onderdrukken van betrokken eiwitten met shRNA technologie zullen correlatie mogelijk maken tussen geïntegreerde functie en gedrag (P6).
Een tweede programma focusseert op GABA-gestuurde ‘fast-spiking’ interneuronen die gereguleerd worden door deze dopaminerge neuronen met de vraag of hun activiteit gestuurd wordt door netwerk oscillaties of door intrinsieke pacemaking. Dit zal onderzocht worden in functionele studies (P6) gebruikmakende van opgezuiverde toxines (P2) die de betrokken K+ kanalen specifiek inhiberen, en door middel van correlatieve studies tussen kanaalfunctie en moleculaire expressie.
WP3. Koppeling van Ca2+ homeostase en elektrische exciteerbaarheid
Tal van ionenkanalen in exciteerbare cellen zijn betrokken in de regulatie van [Ca2+]i maar worden op hun beurt ook gemoduleerd door [Ca2+]i, waardoor Ca2+ regulatieprocessen en exciteerbaarheid elkaar mutueel beïnvloeden. In dit WP zullen we de rol van specifieke ionenkanalen, meer bepaald de connexine hemikanalen, onderzoeken, aangevuld met een meer integratieve benadering.
Connexine hemikanalen zijn niet-selectieve transmembraire ionenkanalen die gemoduleerd worden door, [Ca2+]i maar terzelfdertijd zelf ook Ca2+ influx kunnen mediëren en aldus bijdragen tot [Ca2+]i oscillaties. Preliminaire gegevens (P4, P1) wijzen op de aanwezigheid van functionele connexine hemikanalen in het cardiale myocyten en tonen dat de activatiespanning nodig om deze kanalen te openen verlaagd wordt door een gelijktijdig optredende toename van [Ca2+]i. We gaan de specifieke condities die nodig zijn voor activatie van hemikanalen verder onderzoeken in cardiale myocyten. Functionele studies op het niveau van ‘single channel’ eigenschappen zullen verricht worden in combinatie met specifieke hemikanaal-inhiberende peptiden (P1, P4); dit werk zal aangevuld worden met in silico modeleerwerk om de gevolgen van hemikanaalopening op de electrische eigenschappen van de cardiomyocyten, afzonderlijk en in multicellulaire context, te kunnen afleiden (A. Panfilov, P4). Dit werk is ook essentieel voor de experimentele benadering rondom hemikanaalcontributie in WP4.
De rol van RyR organisatie op [Ca2+]i en de terugkoppeling naar de exciteerbaarheid van de membraan zal bestudeerd worden met behulp van confocale [Ca2+]i beeldvorming en fluorescentie resonantie energie transfer (FRET) studies. Verder zullen we de rol van Ca2+ nagaan in de labiliteit van repolarisatie in intacte cellen en zullen we de bijdrage hiervan als mogelijke functionele biomarker voor arrhythmie onderzoeken (P1, INT1). Voor dit onderzoek zal gebruik gemaakt worden van grote proefdierenmodellen..
WP4. Ligand-geopereerde ionenkanalen bij de plasticiteit van elektrische exciteerbaarheid
In dit WP onderzoeken we de rol van ionotrope neurotransmitter receptoren in plastische veranderingen die optreden tijdens de ontwikkeling van het CZS, in het adulte CZS, zowel onder normale als pathologische condities.
De rol van inhibitorische ligand-geopereerde kanalen, meer bepaald de GlyR, bij de proliferatie en migratie van corticale projectieneuronen en interneuronen tijdens de ontwikkeling zal bestudeerd worden door dynamische Ca2+ beeldvorming (time-lapse), patch-clamp experimenten op ‘slices’, shRNA, en 3D migratie reconstructies (P5, P6).
De invloed van de essentiële NMDA receptor subunit NR1 op de intrinsieke exciteerbaarheid, elektrische netwerk activiteit en synaptische transmissie/ plasticiteit in specifieke subsets van neuronen in het basale ganglia systeem zullen bestudeerd worden met behulp van conditionele transgene muismodellen (P6, P3). De invloed hiervan op het motorische gedragspatroon alsook op het motivatie gedrag zal nagegaan worden onder normale en pathologische omstandigheden (Ziekte van Parkinson en verslavingsgedrag, P6).
WP5. Exploratie van nieuwe benaderingswijzen en moleculaire ‘tools’ die inzicht kunnen verschaffen in de betrokkenheid en rol van specifieke ionenkanalen bij normale en abnormale exciteerbaarheid
De partners binnen het voorgestelde netwerk participeren in de ontwikkeling van nieuwe, specifieke modulatoren van ionenkanalen, gebaseerd op kleine synthetische peptiden, toxines afgeleid vanuit natuurlijke gifsubstanties en organische substanties door middel van ‘library screening’. We maken gebruik van adulte neuronen van het dorsale wortel ganglion (DRG) als een model om natuurlijke gif-toxines te testen en te gebruiken als ‘lead compounds’ voor de verdere ontwikkeling van farmacologisch bruikbare substanties. Tevens gebeurt er ook screening in het Xenopus laevis oocyte expressiesysteem (P2) en in getransfecteerde cellijnen in combinatie met geautomatiseerde patch-clamp metingen (P4, P5) om nieuwe tools te ontwikkelen gebaseerd op toxines met als potentiële therapeutische targets de Nav1.6 kanalen en kanalen van de P2X familie.
Ongecontroleerde opening van connexine hemikanalen gebeurt onder ischemische omstandigheden, ten gevolge van de aanwezigheid van pro-inflammatoire cytokinen of als gevolg van een toename van [Ca2+]i (P4). We gaan nieuwe tools ontwikkelen om de bijdrage van hemikanalen te kunnen onderzoeken in de context van cardiale arrhythmieën (P1, P4, INT1 & INT3). Centraal in deze studies staan kleine synthetische peptiden die interfereren met intramoleculaire interacties in het connexine eiwit en als gevolg daarvan de hemikanalen inhiberen of stimuleren zonder daarbij belangrijke wijzigingen te veroorzaken in de gap juncties die opgebouwd zijn uit twee hemikanalen. (P4).
Tevens gaan we nagaan of gegevens over ionenkanaal remodelering evenals morfologische data bekomen vanuit in vivo metingen in een schaap model van atriale fibrillatie, kunnen integreren in een mathematisch model teneinde de kritische stappen te bepalen die belangrijk zijn bij de progressie van deze aandoening (Willems P1, Panfilov P4).
