Projet de recherche P7/17 (Action de recherche P7)
Dans ce projet, nous analyserons par une combinaison d'imagerie in vivo et de techniques moléculaires la question de savoir comment la plasticité cérébrale est régulée au niveau cellulaire chez deux espèces d'oiseaux chanteurs qui présentent différentes modalités d'apprentissage du chant et de plasticité neuronale. Notre hypothèse est que les hormones et l'environnement induisent la plasticité du cerveau au moins en partie grâce à des modifications épigénétiques définies comme des altérations de l'expression des gènes qui se perpétuent en l'absence du signal d'origine qui les a causés. Des données récentes indiquent que les méthylations de l'ADN, les modifications des histones (acétylation, méthylation) et les ARN non codants (miARN, longs ARNnc) contribuent à la formation et au stockage de la mémoire ainsi qu'à la plasticité neuronale. Ces mécanismes concernent la plasticité du cerveau, mais aussi plus généralement le contrôle d'une variété de conditions cliniques telles que la maladie d'Alzheimer, la dépression, l'anxiété, la schizophrénie et le syndrome de Rett. Leur analyse est donc d'intérêt général.
Le terme de neuroplasticité recouvre une grande diversité de phénomènes allant des changements activité-dépendants dans la physiologie synaptique (e.g., la potentialisation et la dépression à long terme) à des changements morphologiques dans l'organisation du cortex moteur en réponse à une désafférentation périphérique des organes effecteurs ou la re-croissance des nerfs spinaux après lésion. Notre programme de recherche se concentre sur une autre catégorie importante de neuroplasticité, à savoir les changements dans la morphologie, l'organisation et la physiologie du cerveau que se produisent spontanément dans l'ontogenèse et à l'âge adulte sous l'influence des hormones stéroïdes et thyroïdiennes.
Un des exemples les plus dramatiques de plasticité affectant la structure et la fonction du cerveau concerne les structures neuronales de contrôle de la production vocale chez les oiseaux chanteurs. Le cerveau des oiseaux chanteurs (oscines) démontre une plasticité inhabituelle pendant l'ontogenèse ainsi que, pour la plupart des espèces, au travers des saisons. Cette plasticité est directement liée à l'acquisition et à l'expression des chants et fournit donc un modèle utile pour la compréhension de la plasticité neurale et sa relation avec la perception, la cognition, le comportement et les processus cellulaires et moléculaires sous-jacents dans le système nerveux.
Pour des raisons historiques et financières, la recherche sur le système de contrôle du chant et sa plasticité s'est surtout développée aux Etats-Unis, mais en Belgique, deux laboratoires ont significativement contribué à ce domaine de recherche. Depuis le milieu des années 80, le laboratoire de Jacques Balthazart (Liège) a en collaboration avec Gregory F. Ball (Université Johns Hopkins, Baltimore MD) analysé la plasticité saisonnière et l'ontogenèse du cerveau des oiseaux chanteurs ainsi que son organisation neurochimique. A Anvers (UA), le groupe de bio-imagerie d'Annemie Van der Linden a depuis le milieu des années 90 développé plusieurs techniques d'IRM (IRM, ME-IRM, DTI, IRMf, rsfMRI) qui permettent la visualisation in vivo et les études séquentielles du cerveau des oiseaux chanteurs. Ils sont à ce jour des leaders mondiaux dans ce domaine. Balthazart et Van der Linden collaborent depuis 1998 et cette collaboration a abouti à la publication de 13 articles co-signés sans qu'aucun financement spécifique n'ait été obtenu pour cette collaboration.
Le temps est venu de consolider et d'élargir cette collaboration entre Anvers et Liège. Reconnaissant la valeur unique et le potentiel des oiseaux chanteurs comme modèle pour la biologie humaine et la médecine, le NIH américain a financé le séquençage du génome du diamant mandarin qui est maintenant terminée. Des microarrays spécifiques ont également été développés et mis à la disposition de la communauté scientifique afin d'analyser les variations dans l'expression des gènes en réponse à des facteurs environnementaux ou endocriniens. L'addition aux laboratoires qui déjà collaborent, de biologistes moléculaires et d'experts en épigénétique (UA et UGent) permettra des études sophistiquées des bases génétiques et épigénétiques de la plasticité neurale en utilisant les nouveaux outils analytiques développés au cours des dernières années. Ils se sont donc associés avec les Professeurs W. Van Criekinge et T. Demeyer (BIOBIX) qui ont créé en 2009 à l’Université de Gand une plateforme de bioinformatique et de séquençage de masse (Next generation sequencing) (NXTGNT) appliquée à l’étude des bio-marqueurs de la méthylation de l’ADN et avec le Professeur W. Vanden Berghe (UA) avec qui les chercheurs de Gand ont établi depuis longtemps une collaboration consacrée à l’étude de l’expression génique et à l’analyse du méthylome dans plusieurs modèles cellulaires sensibles ou non aux stéroides. En outre, la littérature suggère fortement que les hormones thyroïdiennes devraient jouer un rôle crucial dans le contrôle de cette plasticité, mais étonnamment cette notion n’a jamis été étudiée en relation avec la plasticité du système de contrôle du chant. Un partenaire intégré dans le réseau, le Professeur V. Darras (KUL) s'est spécialisé depuis de nombreuses années dans l'analyse des effets des hormones thyroïdiennes dans le développement des oiseaux et apportera donc son expertise pour l'étude de cette question.
Notre approche expérimentale sera basée, dans une large mesure, sur les techniques d'imagerie cérébrale ont été développés durant la dernière décennie dans le laboratoire de bio-imagerie de l'Université d'Anvers. La plasticité sera d'abord identifiée et décrite dans une variété de contextes par des techniques d'imagerie cérébrale in vivo. Cette approche nous permettra de préciser où et quand la plasticité se produit. Des études seront ensuite réalisées à l'aide de diverse techniques incluant biologie moléculaire, transcriptomique, épigénomique, hybridation in situ, immunohistochimie et traçage des voies neuronales pour définir plus précisément les événements cellulaires et biochimiques sous-jacents à la plasticité observée.
De façon plus précise, 16 tâches (T) organisées en quatre buts expérimentaux indépendants mais néanmoins connexes (BUT) sont décrites dans la présente proposition de subvention.
Dans le BUT 1, nous étudierons les mécanismes génétiques et épigénétiques qui contrôlent le développement des connexions entre HVC et RA dans la voie caudale motrice du système de contrôle du chant des diamants mandarins. Des cerveaux mâles et femelles seront prélevés à l'âge de développement approprié (T1.1). Les ARNm seront analysés par séquençage et confirmés par microarrays adaptés ou QPCR pour identifier les gènes différentiellement exprimés en fonction du sexe et l'âge de développement (T1.2). L'expression différentielle de gènes sélectionnés sera ensuite confirmée par hybridation in situ (ISH) ou l'immunohistochimie (IHC) (T1.3). Un profilage non biaisé de la méthylation de l'ADNg sera utilisé pour établir des cartes de méthylation de l'ADN pendant le développement de HVC et RA qui seront ensuite validées pour des gènes différentiellement exprimés choisis par pyroséquençage des CpG (T1.4). Des anticorps spécifiques des histones modifiées seront ensuite testés en immunofluorescence sur des coupes de cerveau afin de fournir des preuves supplémentaires des mécanismes épigénétiques localisés (T1.5).
Le BUT 2 analysera les effets des hormones stéroïdes et thyroïdiennes sur le contrôle génétique et épigénétique de la croissance axonale chez les diamants mandarins pendant l'ontogenèse. Des techniques d'IRM in vivo seront tout d'abord développées pour permettre la visualisation séquentielle de la connexion entre HVC et RA pendant le développement de diamants mandarins (T2.1). Les effets de l'estradiol (T2.2) ou des hormones thyroïdiennes (T2.3) sur le développement de cette connexion seront décrits par les outils d'IRM développés en T2.1 et par ISH / IHC. Des cerveaux seront alors prélevés aux âges critiques pour profilage génétique et épigénétique (T2.4) comme décrit dans le BUT 1. Enfin une liste de gènes critiques dont l'expression sera significativement affectée en parallèle avec des modifications épigénétiques seront sélectionnés pour analyse causale réalisée par perfusion locale dans le cerveau soit de drogues épigénétiques soit des cofacteurs ou LNA spécifiques ou siRNA contre les enzymes épigénétiques différentiellement exprimés (T2.5).
La démarche du BUT 3 sera copié sur celle du BUT 2 mais analysera le contrôle génétique et épigénétique de la plasticité saisonnière de la connexion entre HVC et RA chez des étourneaux adultes. Cette plasticité sera d'abord analysée par IRM chez des oiseaux soumis à des manipulations photopériodiques destinées à induire un stade physiologique correspondant à l'automne, puis transférés en jours longs pour simuler l'augmentation de la photopériode printanière (T3.1). Les cerveaux seront récoltés à des moments critiques et nous étudierons les changements dans l'expression des gènes et leur contrôle épigénétique pendant le développement de la connexion HVC-RA (T3.2). Les effets des hormones thyroïdiennes sur ces processus seront déterminés par des traitements produisant une hypo-ou hyperthyroïdie (traitement goitrogène / antagoniste ou administration de T3/T4 ; T3.3). Enfin l'expression de certains gènes sera manipulée par technologie antisens afin de tester d'une manière déterminante leur implication dans ce type de plasticité neuronale adulte (T3.4).
Enfin, dans le BUT 4, nous entamerons l'étude des changements du cerveau qui ont lieu pendant d'apprentissage du chant chez les étourneaux adultes. Comme dans le BUT 3, des manipulations photopériodiques seront utilisées pour placer des oiseaux mâles dans un stade physiologique correspondant à l'automne. Ils seront alors exposés à des programmes d'apprentissage du chant. La qualité de leur apprentissage et la qualité des vocalisations nouvelles exprimées seront quantifiées par des outils d'IRM et par enregistrement sonore (T4.1). Si des modifications reproductibles dans l'activité cérébrale en réponse à des chants appris sont détectées par l'IRM, les mécanismes génétiques et épigénétiques sous-jacents seront étudiés par des méthodes similaires à celles utilisées dans les BUT 2 et BUT 3 (T4.2).
Ensemble ces études conduiront à des progrès majeurs dans notre compréhension de la biologie moléculaire (génétique et épigénétique) des mécanismes sous-jacents à la plasticité cérébrale qui se produit spontanément pendant l'ontogenèse ou le cycle annuel sous l'influence des hormones stéroïdes ou thyroïdiennes. Cette connaissance aura un impact significatif pour la compréhension du fonctionnement du cerveau en général (controle du comportement, apprentissage, effets des hormones …) mais elle devrait également avoir un impact sur la compréhension de mécanismes qui pourraient favoriser la réparation du cerveau dans des conditions pathologiques telles que les traumatismes du cerveau ou maladies neurodégénératives.
