Onderzoeksproject P7/17 (Onderzoeksactie P7)
Binnen dit project gebruiken we een combinatie van in vivo beeldvorming en moleculaire technieken om te onderzoeken hoe hersenplasticiteit op cellulair vlak geregeld wordt in twee zangvogelsoorten die verschillend zijn voor wat betreft het leren van zang en neuroplasticiteit. Onze hypothese is dat de hersenplasticiteit geïnduceerd door hormonen en de omgeving minstens gedeeltelijk berust op epigenetische veranderingen in DNA methylatiepatronen, histonmodificaties (acetylatie, methylatie) en expressie van niet coderende RNAs (miRNA, lang ncRNA). Deze epigenetische kenmerken induceren veranderingen in genexpressie die behouden blijven in afwezigheid van het oorspronkelijk signaal dat ze veroorzaakte en kunnen zo bijdragen tot zowel geheugenvorming en opslag als tot neuroplasticiteit. Naast het belang van deze mechanismen voor hersenplasticiteit, kunnen deze ook relevant zijn voor de controle van een reeks klinische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer, depressie, angst, schizofrenie en andere.
De term neuroplasticiteit dekt een brede waaier aan fenomenen, gaande van activiteitsafhankelijke veranderingen in de fysiologie van de synapsen (bvb. Long Term Potentiation en Long Term Depression) tot morfologische veranderingen in de organisatie van de motorcortex als gevolg van deafferentatie van perifere effectororganen of nieuwgroei van spinale zenuwen na beschadiging. Het huidige projectvoorstel spitst zich toe op een andere belangrijke vorm van neuroplasticiteit, namelijk de veranderingen in morfologie, fysiologie en organisatie van de hersenen die spontaan optreden tijdens de ontwikkeling en in adulten onder invloed van geslachtssteroïden en schildklierhormonen.
Enkele van de meest spectaculaire voorbeelden van plasticiteit in hersenstructuur en –functie vinden we in de neurale structuren die de productie van klank controleren bij zangvogels. De hersenen van zangvogels (Oscines) vertonen een sterke plasticiteit niet alleen tijdens de ontogenese maar voor de meeste soorten ook volgens de seizoenen. Deze plasticiteit houdt direct verband met het leren en produceren van zang en vormt dus een waardevol model voor het begrijpen van neurale plasticiteit en de verbanden tussen perceptie, cognitie, gedrag, en de onderliggende cellulaire en moleculaire processen in het zenuwstelsel. Om historische en financiële redenen heeft het onderzoek naar het zangcontrolesysteem en zijn plasticiteit zich vooral ontwikkeld in de USA, maar toch hebben twee Belgische groepen een belangrijke bijdrage geleverd in dit domein. Sinds halfweg de jaren tachtig heeft het laboratorium van Jacques Balthazart (ULg) in samenwerking met Gregory F. Ball (Johns Hopkins University, Baltimore MD) de seizoensgebonden en ontogenetische plasticiteit en zijn chemische neuro-anatomie in het zangvogelbrein onderzocht. Vanaf eind jaren negentig heeft het Bio-Imaging Lab van Annemie Van der Linden in Antwerpen (UA) verschillende MRI technieken ontwikkeld (MRI, ME-MRI, DTI, fMRI, rsfMRI) die in vivo beeldvorming en sequentiële studies in zangvogelhersenen toelaten. Zij zijn tot op heden de wereldleiders in dit domein. J. Balthazart en A. Van der Linden zijn in 1998 een samenwerking gestart en dit heeft intussen reeds geleid tot de publicatie van 13 wetenschappelijke artikels als co-auteur, ook al hebben ze hiervoor nog nooit specifieke fondsen verworven.
Het is het geschikte moment om de samenwerking gestart tussen Antwerpen en Luik niet alleen te consolideren maar ook uit te breiden. De erkenning van de unieke waarde en het potentieel van zangvogels als relevant model voor neuroplasticiteit en cognitie heeft ertoe geleid dat de sequencering van het zebravinkgenoom, dank zij financiering door NIH, recent is voltooid. Er werden micro-arrays ontwikkeld die nu ter beschikking staan van wetenschappers om de veranderingen in genexpressie te bestuderen veroorzaakt door verschillende endocriene- en omgevingsfactoren. Door het uitbreiden van de huidige samenwerking met de expertise van excellente moleculaire biologen en epigenetici wordt het mogelijk de genetische en epigenetische basis van neuroplasticiteit te onderzoeken met behulp van de vele nieuwe analytische tools die de laatste jaren werden ontwikkeld. Hiertoe wordt het team uitgebreid vooreerst met de onderzoeksgroep van Prof. W. Van Criekinge en Prof. T. Demeyer (BIOBIX) die in 2009 een next generation sequencing faciliteit (NXTGNT) oprichtte en een bioinformaticaplatform rond DNA-methylatie biomarkers en RNA-sequencing creëerden beiden aan de UGent en vervolgens met de onderzoeksgroep van Prof. W. Vanden Berghe aan UA, waarmee het UGent team reeds samenwerking had rond genexpressiestudies en MBD-gebaseerde methyloomprofilering in diverse steroïd-gevoelige en -ongevoelige celmodellen. Verder zijn er tal van data in de literatuur die schildklierhormonen in verband brengen met meerdere aspecten van neuroplasticiteit, maar eigenaardig genoeg werd deze mogelijkheid tot nu toe niet onderzocht met betrekking tot neuroplasticiteit in zangvogels. Eén van de partners in het voorgestelde netwerk Prof. Veerle Darras (KUL) is sinds lang gespecialiseerd in het onderzoek naar de rol van schildklierhormonen in de ontwikkeling bij vogels en zal haar expertise mee aanwenden binnen het voorgestelde project om deze invloed verder te bestuderen.
Onze experimentele aanpak is gebaseerd op de technieken en expertise voorhanden binnen de aangesloten teams. Eerst zullen we neuroplasticiteit identificeren via in vivo beeldvorming, wat ons zal toelaten te bepalen waar en wanneer precies deze plasticiteit optreedt. Hierop zullen studies volgen met een waaier van technieken, gaande van moleculaire biologie, transcriptomics, epigenomics, in situ hybridisatie (ISH), immunohistochemie (IHC) om meer in detail de cellulaire en biochemische processen te identificeren die aan de basis liggen van de waargenomen plasticiteit.
Meer precies worden binnen dit projectvoorstel 16 taken (T) omschreven, georganiseerd in 4 onafhankelijke maar toch verwante werkpaketten (WP).
Binnen WP1 willen we de genetische en epigenetische mechanismen bestuderen die de ontwikkeling van de connecties tussen HVC en RA in het vocale motor gedeelte van het zangcontrolesysteem in de hersenen bij jonge zebravinken controleren. Hersenweefsel van mannelijke en vrouwelijke dieren zal verzameld worden op de aangewezen leeftijden (T1.1.). Ze zullen worden onderzocht via RNA sequenering gevolgd door validatie via microarray of QPCR op genen die differentieel tot expressie komen in functie van geslacht en leeftijd (T1.2.). De differentiële expressie van een selectie uit deze genen zal geverifieerd worden via ISH of IHC (T1.3.). Vervolgens zal MBD2-gebaseerde DNA-methylatieprofilering van gDNA gebruikt worden om tijdens de ontwikkeling van HVC en RA integrale epigenoom DNA methyleringsprofielen op te stellen die vervolgens voor een selectie van genen met differentiële expressie gevalideerd zullen worden via CpG pyrosequenering (T1.4.). Tenslotte zal via immunofluorescentie met antilichamen gericht tegen specifieke histonmodificaties (acetylatie, methylatie) bijkomend bewijs worden verzameld voor de ontdekte epigenetische mechanismen (T1.5.).
WP2 omvat de analyse van de effecten van steroïden en schildklierhormonen op de genetische en epigenetische controle van axonale uitgroei tijdens de ontogenese van de zebravink. Eerst zullen de nodige in vivo MRI technieken ontwikkeld worden om sequentiële visualisering van de axonale HVC-RA connectie in ontwikkelende zebravinken mogelijk te maken (T2.1.). De invloed van het geslachtssteroïde oestradiol (T2.2.) en van schildklierhormonen (T2.3.) op de ontwikkeling van deze connectie zal dan onderzocht worden met behulp van de MRI tools ontwikkeld in T2.1. en van ISH/IHC. Op de leeftijden die belangrijk blijken zullen hersenen verzameld worden voor genetische en epigenetische profiling (T2.4.) zoals beschreven in WP1. Tenslotte zal een beperkt aantal genen geselecteerd worden die differentieel tot expressie komen, in overeenstemming met epigenetische modificaties voor verdere functionele studies in vivo. Meer specifiek zal worden nagegaan of infusie in de hersenen van epigenetische inhibitoren of LNA of siRNA (gericht tegen epigenetische enzymen die differentieel tot expressie komen) de verwachte impact heeft op genexpressie, gedrag, geheugen en neuroplastische wijzigingen (T2.5.).
WP3 volgt de opzet van WP2 maar zal de genetische en epigenetische controle van de seizoensgebonden neuroplasticiteit in de HVC-RA connectie onderzoeken bij volwassen spreeuwen. Deze plasticiteit zal eerst opgevolgd worden via MRI in vogels die artificieel onderworpen worden aan dalende fotoperiodes om hen in een fysiologische toestand te brengen representatief voor de herfst en die vervolgens blootgesteld worden aan lange daglengtes om de toename van de fotoperiode in de lente te simuleren (T3.1.). Hersenweefsel zal verzameld worden op gepaste tijdstippen en we zullen de veranderingen in genexpressie en in epigenetische controle nagaan tijdens de ontwikkeling van de HVC-RA connectie (T3.2.). De invloed van schildklierhormonen op deze processen zal onderzocht worden via inductie van hypo- of hyperthyroïdie (behandeling met respectievelijk goitrogenen/antagonisten en T3/T4 toediening; T3.3.). Uiteindelijk zal de expressie van een aantal geselecteerde genen gemanipuleerd worden via antisense technologie om zo op een causale manier hun betrokkenheid bij dit type van neuroplasticiteit te testen (T3.4.).
In WP4 tenslotte zullen we onderzoek starten naar de veranderingen die optreden in de hersenen bij het leren van zang bij volwassen spreeuwen. Zoals in WP3 zullen we de fotoperiode manipuleren om mannelijke vogels in een fysiologische toestand te brengen die overeenstemt met de situatie in de herfst om ze vervolgens bloot te stellen aan nieuwe zanggeluiden. De mate waarin ze nieuwe vocalisaties leren en waar dit in de hersenen gewijzigde activiteit veroorzaakt zal gekwantificeerd worden via MRI technieken en rechtstreekse opname van de zang (T4.1.). Indien we via MRI reproduceerbare veranderingen opmeten in hersenactiviteit in respons op aangeleerde zanggeluiden zullen de onderliggende genetische en epigenetische mechanismen bestudeerd worden met dezelfde methodes als aangehaald in WP2 and 3 (T4.2.).
Al deze studies zullen in belangrijke mate bijdragen tot een beter inzicht in de moleculaire (genetische en epigenetische) mechanismen die aan de grondslag liggen van neuroplasticiteit die spontaan optreedt tijdens de ontogenese en tijdens de seizoenen onder invloed van steroïden en schildklierhormonen. Deze kennis is belangrijk voor het begrijpen van de werking van de hersenen in ruime zin (controle van gedrag, leren, effect van hormonen, …) maar zal ook een impact hebben op het begrijpen van mechanismen die herstel van de hersenen kunnen stimuleren in pathologische condities zoals hersentrauma’s en neurodegeneratieve ziektes.
