Onderzoeksproject P7/28 (Onderzoeksactie P7)
Veel van de microbiële processen die een belangrijke rol spelen bij het tot stand komen van infecties veroorzaakt door bacteriën of fungi kunnen beschouwd worden als “ontwikkelingsprocessen”. De ontwikkeling van een planktonische cel tot een biofilmcel vastgehecht aan een mucosaal oppervlak van een gastheer, bijvoorbeeld, berust op een complex netwerk van regulatorische processen die uiteindelijk de expressieniveaus van een groot aantal genen beïnvloeden. Ook de differentiatie van microbiële cellen met een normale fysiologie tot persister cellen die tolerant zijn tegen vele antimicrobiële agentia kan beschouwd worden als een ontwikkelingsproces, waarbij een strikte regulatie van het metabolisme en genexpressie onontbeerlijk zijn. Als laatste voorbeeld kan de kolonisatie en de daaropvolgende infectie van de mens aangehaald worden. Dit vereist opnieuw de strikte regulatie van genexpressie, zowel in ruimte als tijd. Deze strikte regulatie van genexpressie, die noodzakelijk blijkt om de ontwikkelingsprocessen tot een goed einde te brengen worden vaak rechtstreeks beïnvloed door complexe interacties tussen microbiële cellen.
Het doel van dit project is om de regulatorische mechanismen betrokken bij de belangrijkste microbiële ontwikkelingsprocessen op te helderen. Om dit doel te bereiken hebben we een consortium bestaande uit zeven Belgische partners en één internationale partner samengesteld. Deze acht teams zullen gezamenlijk de taken uitvoeren die ondergebracht werden in zes werkpakketten (WP) :
WP1 : Ontwikkeling en/of optimalisatie van technologieën
WP2 : De rol van nutrient sensing in de ontwikkeling van mono- en multispecies biofilms
WP3 : Persistentie
WP4 : De rol van sRNA en eiwitten die interageren met sRNA in microbiële ontwikkelingsprocessen
WP5 : De rol van intercellulaire communicatie in microbiële ontwikkelingsprocessen
WP6 : Differentiatie van en infectie door -Proteobacteria
Gesofisticeerde instrumenten voor de gedetailleerde analyse van microbiële cellen hebben heel wat nieuwe ontdekkingen in de microbiologie mogelijk gemaakt. In dit projectvoorstel nemen deze nieuwe instrumenten een prominente plaats in bij de analyse van microbiële differentiatie, virulentie en biofilmvorming in vitro en in vivo. In WP1 zullen een aantal state-of-the-art instrumenten gebruikt worden en/of verder ontwikkeld worden en daarna geïmplemteerd worden in de diverse studies. Al deze instrumenten zullen ter beschikking gesteld worden van alle project partners.
Het belangrijkste doel in WP2 is een beter inzicht krijgen in de rol van nutrient sensing in de ontwikkeling van mono- en multispecies biofilms in verschillende omstandigheden. Hiertoe zullen we zowel bacteriële (Staphylococcus aureus) en gist (Candida albicans) monospecies biofilms, als gemengde biofilms (S. aureus-C. albicans) bestuderen. De studie van de moleculaire processen betrokken bij de ontwikkeling en maturatie van deze biofilms zal bestudeerd worden m.b.v. high-throughput transcriptoom analyse (RNAseq).
Om een gedetailleerd beeld te verkrijgen van de mechanismen die aan de basis liggen van de ontwikkeling van extreem-tolerante persister cellen zullen we twee benaderingen gebruiken (WP3). In de eerste benadering zullen we de moleculaire mechanismen betrokken bij de regulatie van gekende genen betrokken bij dit proces onderzoeken. Tegelijkertijd zullen we ook de moleculaire activiteit van de genprodukten, waaronder toxine-antitoxine systemen, bestuderen. In een tweede deelonderzoek zullen we op zoek gaan naar nieuwe genen en functies betrokken bij het persistentie fenomeen.
De hypothese dat sRNA een essentiële rol spelen in het reguleren van de expressie van genen betrokken bij microbiële ontwikkelingsprocessen in Gram-negative bacteriën (o.a. biofilmvorming) zal onderzocht worden in WP4. Een eerste doel in dit WP is het identificeren en karakteriseren van sRNA genen in Burkholderia cenocepacia, d.m.v. RNAseq. Daaropvolgend zullen we de specifieke rol van deze sRNA in de vorming van mono- en multispecies biofilms onderzoeken. Hiertoe zal gebruikgemaakt worden van deletie en overexpressie mutanten. Een tweede doelstelling binnen dit WP is de gedetailleerde karakterisering van CsrA, een eiwit dat betrokken is in sRNA interacties in Escherichia coli.
In WP5 zullen we een aantal vragen omtrent quorum sensing en quorum quenching in Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën trachten te beantwoorden. We zullen onderzoeken hoe QS de ontwikkeling van virulentie in Brucella-geïnfecteerde cellen mee stuurt en in welke fase van het vacuolair transport. Daarnaast zullen we nagaan hoe de QS systemen van Burkholderia spp. Gereguleerd worden door sRNA. Een laatste doel binnen dit WP is onderzoeken hoe Rgg/comR-like QS regulatorische systemen de populatiedynamiek van verschillende streptococcen beïnvloeden.
WP6 is gewijd aan de studie van drie aspecten van de bacteriële cel cyclus die typisch zijn voor gedifferentiëerde celtypes in de -Proteobacteria Rhizobium etli en Brucella abortus. Deze drie aspecten zijn de groei sites, de initiatie van genoom replicatie en cellulaire asymmetrie. Voor elk van deze drie aspecten zullen we gebruikmaken van moleculaire merkers die deze events kunnen opsporen in bacteriën terwijl die interageren met hun gastheer. De gedifferentiëerde celtypes zullen bovendien op moleculair vlak in kaart gebracht worden, door gebruik te maken van transcriptoom en metaboloom analyse. Tenslotte zullen we ook de moleculaire mechanismen van de transitie tussen de verschillende gedifferentiëerde celtypes onderzoeken.
We zijn er van overtuigd dat dit geïntegreerd netwerk het ons zal mogelijk maken om de grenzen van de bestaande kennis aanzienlijk te verleggen en dat ons gezamenlijk projectvoorstel zal leiden tot significante doorbraken in het onderzoek omtrent microbiële ontwikkelingsprocessen.
