Onderzoeksproject P7/40 (Onderzoeksactie P7)
Inleiding
De G proteïne-gekoppelde receptoren (GPCR’s) vormen de grootste klasse van integrale celmembraanreceptoren. Deze receptoren en hun brede waaier van liganden spelen een voorname rol in alle aspecten van de fysiologie en de pathofysiologie. Ze dienen dan ook als doelwit voor ongeveer de helft van alle therapeutische agentia. Lang werd aangenomen dat GPCR’s als monomeren functioneren, maar hoe langer hoe meer wordt aangenomen dat ze homo- en heteromere complexen vormen. Bovendien zijn ze verankerd in membraanregio’s met specifieke lipide/(glyco)proteïne-componenten. Deze contextuele factoren moduleren de signaaloverdracht en kunnen aan de basis liggen van ziekte-specifieke receptorontregelingen. De partners van het huidige onderzoeksprogramma hebben al een vooraanstaande rol gespeeld in de karakterisering van diverse GPCR’s en hun liganden bij gisten, insecten en zoogdieren. Het onderzoek naar GPCR’s zit momenteel in een zeer boeiende fase van ontwikkeling. Structurele gegevens komen aan een sneltempo beschikbaar en beïnvloeden sterk alle andere aspecten van het onderzoek. Gebaseerd op de aanwezige ervaring in het netwerk, en dankzij de inbreng van nieuwe partners en wereldwijde externe samenwerkingen, kunnen we koplopers blijven in GPCR-onderzoek. Met een nieuwe focus op structuuranalyse zullen we algemene en specifieke aspecten van GPCR’s verder bestuderen met als ultiem doel de levenskwaliteit en gezondheid van mensen te verbeteren.
Onderzoek naar structuurveranderingen bij GPCR’s
We zullen de kristallografische structuur van welbepaalde GPCR’s in hun verschillende functionele conformaties bepalen. Hiervoor gaan we recombinante monoclonale antilichamen met een enkele keten (nanobodies) van Camelidae aanmaken. Deze nanobodies kunnen welbepaalde conformaties van de receptoren stabiliseren (inactief, actief, complexen met G proteïnen, -arrestines of andere interactiepartners). Ze zullen zowel aangewend worden voor het zuiveren van correct gevouwen receptoren als voor de kristallisatie van deze receptoren. De structuren van deze kristallen zullen bepaald worden met behulp van X-stralendiffractie in samenwerking met enkele buitenlandse groepen (Brian Kobilka, Stanford, VSA; Gebhard Schertler, Paul Scherrer Institute, Zwitserland). De kristalstructuren zullen verder aangewend worden voor het modelleren van de structurele organisatie van andere GPCRs en van hun interactie met kleine liganden en signaalproteïnen (agonisten, antagonisten, allosterische modulatoren, G proteïnen, kinasen, β-arrestines), om het inzicht in de activatiemechanismen van GPCR’s te verruimen. Met behulp van de verkregen structurele informatie zullen we tevens de functionele gevolgen van GPCR-oligomerisatie in vitro en in diermodellen analyseren.
Signaaltransductiewegen van GPCRs
De signaleringseigenschappen van geselecteerde receptoren, afkomstig van de mens, insecten en gist, zullen bestudeerd worden met een uitdrukkelijke focus op de recente concepten van G proteïne-onafhankelijke signaalwegen, “biased” agonisme, allosterische regulatie in receptoroligomeren en interactiviteit met andere signaalwegen. Wijzigingen in signalering in functie van de gebruikte liganden, interacties van de receptor met andere partners (andere receptoren, kinasen, β-arrestines) en de receptoromgeving (lipiden in het membraan) zullen nader geanalyseerd worden. Energie-transfertechnieken zullen aangewend worden om de directe interactie te bestuderen van receptoren met welbepaalde G proteïne-subeenheden en andere signaleringspartners, evenals hun activering. Vergelijkende signaleringsanalyses zullen gemaakt worden tussen zoogdieren, insecten en gistcellen, gebaseerd op structurele en functionele analogieën. Bovendien zullen nieuwe signaalwegen en/of regulatiemechanismen geëxploreerd worden en er zal bestudeerd worden of deze die ontdekt worden bij de ene soort eveneens bij de andere soorten voorkomen om hun universele karakter te bepalen.
Identificatie van nieuwe receptoren en hun liganden
In de genomen van zoogdieren en insecten zijn er nog steeds veel weesreceptoren te vinden waarvoor de liganden en de functies niet gekend zijn. Wij zullen ons concentreren op de karakterisering van deze receptoren, door identificatie van hun liganden en de daarop volgende bepaling van hun functies. Verscheidene van deze opsporingsprogramma’s zijn reeds gestart gedurende de vorige fase (aan de gang zijnde identificatie van liganden en/of opheldering van biologische activiteiten), en deze programma’s zullen verdergezet worden gedurende IUAP-fase VII. We zullen humane receptoren voor chemoattractantia voor leukocyten (bv. Chemokines met of zonder posttranslationele modificaties), neuropeptiden, glycoproteïne-hormoon-achtige eiwitten en glucose, receptoren van insecten voor neuropeptiden en peptide/proteïne-hormonen, en nutriëntreceptoren in gist bestuderen. Fylogenie en evolutionaire informatie zullen aangewend worden bij deze benadering.
Functionele karakterisering van welbepaalde receptoren in fysiologische processen en ziekten
Als voornaamste klasse van signaaltransducerende membraanreceptoren, vervullen GPCR’s een prominente, regulatorische functie in vele biologische processen. Een aantal specifieke receptoren, waarvan er verscheidene geïdentificeerd werden door de partners in de voorbije jaren, zal in detail bestudeerd worden om hun rol in fysiologische processen, en hun betrokkenheid bij humane ziekten, te bepalen. We zullen hierbij vier onderzoeksgebieden beschouwen die van cruciaal belang zijn voor de ontwikkeling van toekomstige, therapeutische toepassingen, namelijk metabolisme, immuniteit, kanker, en aandoeningen van het centraal zenuwstelsel. Voor elk van deze gebieden, waarin ons consortium een uitgebreide expertise vertegenwoordigt, zal deze benadering zowel in vitro studies, als onderzoek naar in vivo modellen voor ziekten en genetisch gemodificeerde organismen omvatten, gecombineerd met geavanceerde post-genomische en fenomische benaderingen. We zullen ondermeer onderzoek verrichten naar glycoproteïne-hormoonreceptoren tijdens de ontwikkeling van insecten en zoogdieren, receptoren voor chemoattractantia en nucleotiden in immuniteit en kanker bij zoogdieren, neuropeptide-receptoren bij zoogdieren en insecten, en nutriënt-GPCR’s in gist en zoogdieren. Meerdere partners zullen in onderling overleg bijdragen aan elk van deze gebieden. De resulterende (patho)fysiologische gegevens zullen aangevuld worden met informatie die verkregen wordt uit andere projectonderdelen.
Het netwerk
De samenstelling van ons consortium verzekert de voortzetting van beloftevolle activiteiten en interacties ingeleid in de voorgaande fase en laat tevens toe om nieuwe en ontluikende thema’s in het GPCR-onderzoek te incorporeren. In dit aangepast netwerk hebben we een nieuwe Belgische partner (P4, Jan Steyaert, VUB) aangetrokken, die een cruciale rol heeft gespeeld in recente doorbraken op het gebied van structuuranalyses van GPCRs. Het gebruik van nanobodies, ontwikkeld door deze groep, is inderdaad doorslaggevend geweest voor het bepalen van de eerste kristalstructuur van de β2-adrenerge receptor in een actieve conformatie, en tevens voor de bepaling van de structuur van het complex gevormd door deze receptor en zijn G proteïne. We verwachten dat deze recente ontwikkelingen in de komende jaren zullen leiden tot een ware explosie aan nieuwe structurele gegevens over GPCRs en dat ons Belgisch netwerk een even essentiële rol zal kunnen blijven spelen in dit fascinerend onderzoeksgebied. We hebben ook een nieuwe buitenlandse partner (INT1, Silvano Sozzani, Brescia, Italy) opgenomen, die momentaal al sterk verweven is met twee van de Belgische partners (P1 and P3) in de domeinen van immuniteit en kanker. De laatste jaren was er ook een lang verwachte convergentie tussen signaalwegen geactiveerd door GPCR’s bij gist en bij meercellige organismen, zoals insecten en zoogdieren. Naast de conceptuele en technologische uitwisselingen die in de vorige fase al plaatsvonden tussen P3 en de andere partners, is er nu ruimte voor een meer diepgaande integratie van de objectieven van partners die onderzoek verrichten naar GPCR’s bij zoogdieren, insecten en gist, ondermeer met betrekking tot de structuur, signaleringscascades en werkingswijze van GPCR’s in de regulatie van het metabolisme van cellen en organismen. Het netwerk zal verder zijn cohesie rond een aantal gemeenschappelijke doelen versterken en zal die samenhang vereenvoudigen door het organiseren van internationale meetings en workshops, zomercursussen en de voortzetting van studentenuitwisselingen.
