Projet de recherche P7/47 (Action de recherche P7)
Les cellules progénitrices du foie humain adulte sont localisées dans un microenvironnement spécialisé et dynamique qualifié de niche. Lors d’une agression hépatique par un virus ou un agent toxique, les hépatocytes sont détruits par nécrose ou apoptose ou endommagés de sortent qu’ils ne peuvent se répliquer pour régénérer l’organe. La régénération du tissu lésé peut cependant se faire partiellement par l’intermédiaire des cellules progénitrices. Ce processus est stimulé par une variété de signaux, dont des facteurs de croissance et la matrice de soutien produits par la niche. Les cellules progénitrices hépatiques (LPC pour "liver progenitor cells") représentent dès lors une source potentielle de cellules pour la thérapie cellulaire hépatique et une cible potentielle pour l’induction de la régénération hépatique in vivo. Cependant, avant de pouvoir envisager ces applications, il est crucial d’identifier et de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent l’activation et la différenciation des LPC et leur participation dans l’initiation, la progression et la résolution des pathologies hépatiques. De même, les interactions entre la niche et les LPC sont particulièrement importante.
Dans la foulée des résultats obtenus durant le projet HEPRO-1, centrés sur les cellules progénitrices dans le foie normal, le présent projet HEPRO-2 est centré sur les cellules pro¬génitrices et leur niche dans le foie humain malade. L’accent sera mis sur l’aspect translationnel de la recherche. La caractérisation moléculaire des cellules progénitrices et de leur niche dans les hépatopathies humaines sera le point de départ de nos recherches. Ces donnés seront acquises par analyse des LPC et de leur niche microdisséquées au laser dans des tissus humains collectés dans nos banques de tissus. Dans une optique translationnelle, l’étude de modèles animaux et de modèles in vitro permettront de caractériser les mécanismes qui sous tendent ces observations cliniquement pertinentes. Le plan expérimental est découpé en 5 parties (workpackages) et sera mené à bien grâce à une intense collaboration entre 4 partenaires belges et 2 partenaires internationaux. Les objectifs principaux de ce projet HEPRO-2 peuvent être résumés comme suit :
1. Caractérisation moléculaire des cellules progénitrices dans le foie malade ou normal afin d’identifier et de comprendre les déterminants moléculaires (facteurs de transcription, facteurs de croissance, microRNAs) de leur différenciation hépatocytaire ou cholangiocytaire et leur rôle dans l'initiation la progression et la résolution de maladies hépatiques. Les LPC isolées de modèles animaux seront, dans des expériences in vitro et in vivo, comparées aux LPC isolées de foies humains. Les techniques d’isolement ("side population", isolement basé sur l’expression de l’aldehyde dehydrogensase) et traçage génétique de lignées au moyen de souris transgéniques (CK19-Cre;Rosa26R-YFP and Sox9-Cre;Rosa26R-YFP) ont été développées en collaboration durant le projet HEPRO-1. De plus, un modèle unique de traçage des LPC sera évalué, à savoir les souris transgéniques Ostéopontine-CreER ;RosaR26-YFP. Les pathologies hépatiques investiguées seront les hépatites chroniques virales B et C, la cirrhose hépatique, les pathologies stéatosiques du foie, les hépato-et cholangiocarcinomes et le foie polykystique. Nous envisagerons également l’optimalisation des méthodes in vitro de maturation de progéniteurs extra-hépatiques (par ex dérivés de la peau humaine) en cellules se rapprochant le plus possible du type hépatocytaire en vue de leur utilisation comme source alternative pour la thérapie cellulaire et pour les applications de pharmaco-toxicologie in vitro.
2. Dynamique de la niche des cellules progénitrices : l’environnement des LPC participe au maintien de LPC dans leur état progéniteur et régule leur activation. Comprendre comment cette niche est structurée, maintenue, transformée et comment ses caractéristiques modulent l’activation des LPC est un pré-requis au développement de traitements visant à promouvoir une cicatrisation harmonieuse du foie chroniquement malade. Nous utiliserons des outils transgéniques de traçage de lignées cellulaires, de microdissection au laser, ainsi que l’administration ciblée aux cellules qui composent ce microenvironnement de drogues, siRNA ou modulateurs de microRNA par voie virale ou par l’intermédiaire de liposomes, afin de mieux comprendre les relations moléculaires participant au maintien de la niche. Nous identifierons également le rôle des différents types cellulaires présents au sein de la niche (en particulier les cellules stellaires et les cellules de Kupffer), dans l’activation des cellules progénitrices. L’architecture de la niche sera établie par une reconstruction tridimensionnelle dans les modèles animaux et dans les hépatopathies chroniques humaines à l’aide de marqueurs spécifiques aux différents types cellulaires.
3. Développement de nouveaux systèmes de modélisation pour l’étude des pathologies hépatiques chroniques.
3.1. Modélisation in vivo : l’efficacité avec laquelle les LPC (de souris vs humaines, isolées de foies sains ou malades) sont capables de repeupler en hépatocytes un foie déficient sera étudiée dans le modèle de souris immunodéficientes hypertyrosinémiques, les souris FRG (fumarylacetoacetate-hydrolase (FAH)-/-, IL2Rγ-/-, Rag2-/-). Celles-ci permettent l’induction d’une insuffisance hépatique à la demande. Des comparaisons seront faites avec les souris uPA+/+-SCID (‘urokinase-type plasminogen activator – severe combined immune deficient’), le standard actuel, modèle qui a été utilisé avec succès lors du projet HEPRO-1 pour étudier les capacités régénératrices des LPC. De plus, la caractérisation du modèle de knockout conditionnel NemoΔhepa sera poursuivie et ce modèle utilisé comme alternative pour les études de transplantation ainsi que pour évaluer l’activation des LPC dans des conditions de stress oxydant mimant celles retrouvées
dans certaines hépatopathies chroniques humaines.
3.2. Modélisation in vitro : -Pour l’instant, il n’y a pas de modèle robuste de culture prolongée d’hépatocytes. Ceci constitue un frein pour l’étude in vitro des conséquences à long terme des xénobiotiques (en particulier les carcinogènes) ou de l’infection virale. Ici, nous explorerons les possibilités d’utilisation de 2 nouveaux modèles tridimensionnels de foies humains ou humanisés : (i) la matrice extracellulaire décellularisée et repeuplée par différentes cellules hépatiques (de foies sains ou malades, cellules progénitrices, hépatocytes matures ou en voie de différenciation) et (ii) un nouveau modèle de culture tridimensionnelle où les hépatocytes et les cellules non-parenchymateuses sont cultivées sur une trame synthétique en nylon. -De nombreux éléments suggèrent que les LPC sont à l’origine de (certains) cancers hépatiques, bien qu'il y ait peu d’éléments pour indiquer qu’elles puissent être la cible directe de carcinogènes génotoxiques ou de promoteurs tumoraux. Nous utiliserons un modèle de cellules progénitrices hépatiques de rat, précédemment utilisées dans HEPRO-1, pour évaluer l’expression de biomarqueurs d’importance pour la carcinogenèse en réponse à l’exposition à des carcinogènes génotoxiques.
