Onderzoeksproject P7/47 (Onderzoeksactie P7)
In de menselijke lever zijn volwassen progenitorcellen aanwezig in een speciale dynamische micro-omgeving, die stamcel niche of progenitorcel niche genoemd wordt. Wanneer hepatocyten beschadigd worden door ziekte of door chemische blootstelling, ondergaan ze apoptotische
en/of necrotische celdood en zijn ze niet meer in staat om te delen om het leverweefsel te herstellen. Echter, herpopulatie van het beschadigde leverweefsel met functionele levercellen is gedeeltelijk mogelijk via proliferatie en differentiatie van deze lokale progenitorcellen. Dit proces
wordt geactiveerd door allerlei signalen, groeifactoren en ondersteunend weefsel aangemaakt door de stamcel niche. Progenitorcellen van de lever (LPC) vormen daarom een aantrekkelijke bron voor humane leverceltherapie en een doelwit voor de in vivo inductie van hepatisch herstel.
Om dit echter mogelijk te maken, is het van cruciaal belang om de sleutelmechanismen die de activatie en differentiatie van LPC controleren op cellulair en moleculair niveau te identificeren en te begrijpen.
Naast de kennis van hun aandeel in de aanzet, het verloop en het herstel van de leverpathologie of leverbeschadiging is het ook belangrijk om de wisselwerking te kennen tussen de niche en de LPC.
Het HEPRO-2 project bouwt verder op de reeds bekomen resultaten in HEPRO-1. Dit laatste project was vooral gericht op LPCs in gezonde lever, terwijl HEPRO-2 zich toespitst op de LPCs en de bijhorende niche in humane leverziekten of bij chemische leverbeschadiging. In dit project speelt het translationeel aspect een voorname rol. Inderdaad, het uitgangspunt zal bestaan uit de moleculaire karakterisatie van de LPCs en hun niche, die geïsoleerd worden via een nieuwe Lasure Capture Microdissection techniek. De stalen zullen hierbij afkomstig zijn van een grote humane leverweefselbank die behoort tot één der partners. Doorheen het ganse project zullen deze resultaten vergeleken worden met alle vindingen bekomen via in vivo en in vitro onderzoek. Op deze manier zal de klinische relevantie gegarandeerd worden. Het onderzoekswerk is
gebundeld in 5 onderdelen en zal gerealiseerd worden door intensieve samenwerking tussen 4 nationale en 2 internationale onderzoeksgroepen. De voornaamste doelstellingen van het HEPRO-2 project kunnen als volgt samengevat worden:
1. Moleculaire karakterisatie van progenitorcellen in pathologische versus normale condities: dit onderzoek gebeurt om de voornaamste moleculaire factoren en condities te identificeren en te begrijpen (transcriptiefactoren, groeifactoren, microRNAs) die bepalend zijn voor de differentiatiecapaciteit van de LPCs naar hepatocyten of cholangiocyten en hun deelname te kennen aan de verschillende stadia van leverziekte en bij chemische leverbeschadiging. Hiertoe zullen LPCs afkomstig van verschillende knaagdiermodellen voor leverziekte, zowel via in vivo als in vitro onderzoek, op moleculair niveau vergeleken worden met de resultaten bekomen bij humane leverziekten. Hierbij zullen de isolatietechnieken (‘side population’ en aldehyde dehydrogenase methode) en de opsporingstechnieken om de herkomst der cellen te traceren (CK19-Cre;Rosa26R-YFP and Sox9-Cre;Rosa26R-YFP muizen), die eerder ontwikkeld werden in het HEPRO-1 project, gebruikt worden. Naast de genoemde transgene muizen zal ook een derde transgene muis uitgetest worden, de zogenaamde Osteopontin-CreER; Rosa26R-YFP muis. De leverziekten die zullen bestudeerd worden omvatten virale hepatitis B en C, levercirrhose, niet-alcoholische vette lever en niet-alcoholische steatohepatitis, hepato/cholangiocarcinoma en polycystische lever. Verdere optimisatie van het in vitro maturatieproces van extra-hepatische progenitors (namelijk progenitors afkomstig van humane huid) naar hepatocytachtige cellen wordt uitgevoerd daar deze interessant zijn als alternatieve cellenbron voor het herstellen van leverschade en voor het gebruik van humane hepatocyten als in vitro model voor farmaco-toxicologische toepassingen.
2. Het dynamische karakter van de progenitorcel niche : de onmiddellijke omgeving van de LPCs regelt het behoud en de activatie van deze cellen. De karakterisatie van hoe deze niche gestructureerd is en hoe deze structuur behouden blijft en tevens hoe de niche de LPCs activeert zijn vragen die eerst moeten beantwoord worden alvorens therapieën voor leverbeschadiging kunnen uitgewerkt worden. Door gebruik te maken van de reeds vernoemde transgene muizen, liposoom-en viraal-gemedieerde afgifte van moleculen en siRNA/microRNA, en de verfijnde Laser Capture Microdissection techniek, zal de moleculaire wisselwerking die belangrijk is voor het behoud van de LPC niche kunnen gekarakteriseerd worden. Tevens kan de rol in de activatie van de LPCs voor de verschillende celtypes in de niche, zoals stellaatcellen en Küpffer cellen, geïdentificeerd worden. Tenslotte zal de gevonden niche structuur voor de diermodellen en voor humane chronische leverziekten driedimensioneel gereconstrueerd worden door gebruik te maken van merkers en ‘tracer’ moleculen die celtype-specifiek zijn.
3. Ontwikkeling van nieuwe modelsystemen om leverziekte/chemische leverbeschadiging te bestuderen : daar de huidige knaagdiermodellen voor leverziekte meestal volwassen hepatocyten als doelwit hebben, is er een duidelijke nood aan nieuwe modellen waarin progenitorcellen het doelwit zijn.
3.1. In vivo modelsystemen :
De repopulatie-efficiëntie van geïsoleerde LPCs (mens/knaagdier; gezond/ziek) zal bestudeerd
worden in een nieuw immuundeficiënt FRG muismodel (fumarylacetoacetaat-hydrolase (FAH)-/¬Rag2-/-). Dit zal toelaten om leverbeschadiging te induceren en te vergelijken met de resultaten bekomen in het uPA+/+-SCID (urokinase-type plasminogen activator – severe combined immune deficient) model dat succesvol werd toegepast binnen het HEPRO-1 project om het regeneratieve karakter van LPCs te bestuderen. Ook het nieuwe NemoΔhepa conditionele knockout muismodel zal verder gekarakteriseerd worden om als alternatief transplantatiemodel gebruikt te worden. Tevens zal dit model ook aangewend worden om LPC activatie te bestuderen onder condities die een weerspiegeling zijn van de progressie van chronische leverziekte zoals vastgesteld bij de mens.
3.2. In vitro modelsystemen
Tot op heden zijn er geen robuuste lange-termijn cultuursystemen voor levercellen voorhanden. Dit heeft een negatief effect op de in vitro researchmogelijkheden voor lange¬termijn effecten van xenobiotica zoals van carcinogene substanties of virale infecties. In dit project zullen 2 nieuwe gehumaniseerde driedimensionele levermodellen onderzocht worden. Een eerste model is de natuurlijke gedecellulariseerde levermatrix die gerecellulariseerd wordt met verschillende (gezonde/zieke) levercellen (progenitorcellen, reeds in een bepaalde richting gestuurde progenitorcellen, hepatocyten,…). Een tweede nieuw model bestaat uit een humaan driedimensioneel levermodel waarbij zowel hepatocyten als niet-parenchymale levercellen gecultiveerd worden op een synthetische nylonstructuur. -Hoewel het meer en meer duidelijk wordt dat tumoren afkomstig kunnen zijn van progenitorcellen is er nog weinig geweten of deze cellen ook een direct doelwit zijn voor genotoxische carcinogenen of tumorpromotoren. Hiertoe zullen progenitorcellen, afkomstig van rattenlever en gekarakteriseerd tijdens het HEPRO-1 project, gekweekt en blootgesteld worden aan genotoxische carcinogenen om na te gaan of er specifieke biomerkers tot expressie komen die ook in vivo relevant zijn voor levercarcinogenese.
