 |  |
|
Prof. R. De Wachter, UIA, Dep. Biochemie, Universiteitsplein 1, 2610 Wilrijk
De laatste 15 jaar is de belangstelling voor Campylobacter spp. binnen de levensmiddelenindustrie enorm toegenomen. Immers is het aantal vastgestelde infecties veroorzaakt door opname van Campylobacter via het voedsel jaar na jaar gestegen. In sommige Westerse landen overstijgt het aantal gemelde gevallen van campylobacteriose zelfs het aantal gevallen van salmonellose en shigellose samen. Campylobacters maken deel uit van de normale darmflora van warmbloedigen, waaronder runderen, varkens, schapen en pluimvee. Tijdens het slachtproces en de verdere verwerking kan kruisbesmetting optreden. Geschat wordt dat tot 100% van alle kip- en gevogelteproducten in de handel gecontamineerd zijn met campylobacters. Door onvoldoende verhitting of kruisbesmetting kan de consument geïnfecteerd worden; de infectiedosis voor Campylobacter is daarenboven zeer laag (ongeveer 500 cellen).
Bij de screening van een groot aantal kip- en gevogelteproducten, afkomstig uit slachterijen en de groot- en detailhandel, konden uit meer dan 30% van de stalen Campylobacter spp. gesoleerd worden. Het merendeel werd geïdentificeerd als C. jejuni. Daar de conventionele detectiemethoden voor Campylobacter spp. tijdrovend en arbeidsintensief zijn, werden twee commercieel beschikbare DNA testkits voor de bepaling van Campylobacter in levensmiddelen geëvalueerd op snelheid, specificiteit en gevoeligheid. Beide kits vertoonden een bijna 100%-ige specificiteit, doch voor het bekomen van een positief signaal bleken minstens 107 Campylobacter cellen per ml aanwezig te moeten zijn, m.a.w. aantallen die slechts na een langdurige aanrijking worden verkregen. De relatief snelle uitvoering van de kit (45 min. tot 3 h) wordt teniet gedaan door een 2-dagen aanrijking. Vooral een techniek voor het inkorten van de aanrijkingsperiode leek noodzakelijk. De keuze hiervoor viel op het toepassen van de zgn. immunomagnetische scheiding (IMS), een techniek waarbij micro-organismen uit een voedselstaal geësoleerd en geconcentreerd worden door binding aan specifieke antilichamen die gecoat werden op magnetische partikels. Door toepassing van een magnetische veld kunnen deze deeltjes met de daarop gebonden organismen afgescheiden worden en hetzij traditioneel uitgeplaat, hetzij toegepast worden in snelle detectietechnieken. In dit onderzoeksproject werd gebruik gemaakt van de commerciële Dynabeads© M-280 tosylactivated die gecoat werden met het commerciële geit anti-Campylobacter antilichaam. Testen toonden aan dat er een goede binding tot stand kwam tussen de Dynabeads en het antilichaam enerzijds en tussen het antilichaam en het antigen (Campylobacter) anderzijds.
Bij het werken met Campylobacter-reinculturen in vloeibare media werd in de eerste plaats gestreeft naar een optimalisatie van de IMS-techniek door het effect van de voornaamste procesparameters te onderzoeken. Bij het nagaan van de gevoeligheid en specificiteit van het IMS-systeem met reinculturen werden opbrengsten tot 35% bekomen, terwijl onder optimale omstandigheden een detectielimiet van ongeveer 200 Campylobacter cellen werd gehaald. Bij het gebruik van IMS in gemengde culturen werd het optreden van kruisreactiviteit en aspecifieke bindingen door andere organismen vastgesteld.
De IMS-techniek werd tenslotte toegepast op 90 natuurlijk besmette kippestalen. Een voorafgaandelijke vooraanrijking en aanrijking (totaal: 7 h) werden utgevoerd, waarna de IMS-techniek, in parallel met de klassieke detectiemethode voor Campylobacter, werd toegepast. De beads werden na scheiding enerzijds uitgeplaat op een aantal selectieve isolatiemedia voor Campylobacter spp. en anderzijds toegepast in een specifiek PCR-assay. Met de klassieke detectiemethode werden ongeveer 50% van de stalen positief bevonden. De combinatie IMS - uitplating leverde slechts in 12% van de stalen een positief resultaat op, terwijl bij de combinatie IMS - PCR 63% van de stalen positief werden bevonden. Niet alleen werd door de combinatie van een specifieke concentratietechniek (IMS) met een gevoelige en zeer specifieke identificatiemethode (PCR) een groter aantal positieve stalen gedetecteerd, de resultaten werden bovendien veel sneller bekomen. Daar waar de klassieke detectiemethode ten vroegste na 72 h een nog onbevestigd resultaat geeft, wordt met de combinatie IMS - PCR binnen de 30 h, onder ideale omstandigheden zelfs binnen de 12 h, een specifiek antwoord bekomen.
De conventionele methoden die aangewend worden voor de detectie en identificatie van campylobacters zijn langdurig, arbeidsintensief en soms zelfs onbetrouwbaar. Een alternatieve snelle en gevoelige detectiemethode is de polymerase kettingreactie of PCR. In eerste instantie werd een methode ontwikkeld gebaseerd op 16S rDNA. Op basis van reeds beschikbare en nieuwe door ons bepaalde 16S rDNA sequenties werden universele PCR primers en groep-specifieke oligonucleotide probes ontwikkeld. PCR amplificatie gevolgd door hybridisatie laat een groep-specifieke detectie van enteropathogene campylobacters toe. Gezien het 16S rDNA zijn beperkingen had met betrekking tot de ontwikkeling van species-specifieke detectie, werd overschakeld op het 23S rDNA.
Er werd een methode ontwikkeld voor de specifieke detectie van Campylobacter en Arcobacter die gebaseerd is op het 23S rDNA. Op basis van een 40-tal door ons bepaalde sequenties van een variabel gebied van het 23S rDNA, werden specifieke PCR primers ontwikkeld voor de (a) groep-specifieke detectie van thermofiele campylobacters, (b) species-specifieke detectie van thermofiele campylobacters, (c) species-specifieke detectie van niet-thermofiele campylobacters, (d) groep-specifieke detectie van arcobacters, en (e) species-specifieke detectie van arcobacters.
Met behulp van de PCR primers specifiek voor de thermofiele en niet-thermofiele campylobacters, kon de identificatie plaatsvinden van klinische isolaten, die geen eenduidig beeld gaven op basis van andere analyses.
De PCR assay voor de groep-specifieke detectie van thermofiele campylobacters werd toegepast op de detectie van Campylobacter spp. in aangerijkte voedselstalen. Er werden 144 kipmonsters onderzocht waarvan ongeveer 46% positief bleek te zijn op basis van de PCR assay, terwijl ongeveer 43% positief bleek te zijn op basis van de conventionele methoden. In ongeveer 34% van de voedselstalen leverden de PCR assay en de conventionele methoden tegenstrijdige resultaten op. Verder onderzoek wees uit dat dit niet het gevolg was van een detectie van dode Campylobacter cellen door de PCR assay of door een verschil in de detectielimiet van beide methoden.
Een alternatieve methode voor de detectie van PCR producten, namelijk PCR ELISA, werd uitgetest. Het voordeel van de PCR ELISA t.o.v. de conventionele analyse van PCR producten is niet de sensitiviteit, die van dezelfde grootte orde blijkt te zijn, maar wel de mogelijkheid om een geautomatiseerde detectie uit te voeren, die een gelijktijdige verwerking van een groot aantal stalen toelaat.
| |