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Prof. R. De Wachter, UIA, Dep. Biochemie, Universiteitsplein 1, 2610 Wilrijk
Au cours de ces 15 dernières années, l'industrie alimentaire a manifesté un intérêt croissant à l'égard des Campylobacter spp. De plus, le nombre d'infections observées, consécutives à une ingestion du Campylobacter par l'alimentation n'a cessé d'augmenter. Dans certains pays occidentaux, le nombre de cas de campylobactériose signalés dépasse même le nombre de cas de salmonellose et de de shigellose réunis. Les campylobacters font partie de la flore intestinale normale des mammifères, parmi lesquels les bovins, les porcins, les ovins et la volaille. Au cours de l'abattage et des transformations ultérieures, une contamination croisée peut intervenir. On estime jusqu'à 100% le nombre de poulets et d'autres produits avicoles commercialisés, contaminés par les campylobacters. Des températures de cuisson insuffisantes ou une contamination croisée peuvent infecter le consommateur ; la dose infectieuse du Campylobacter est par ailleurs très faible (environ 500 cellules).
Le contrôle d'un nombre important de poulets et de produits avicoles, issus des abattoirs, du commerce de gros et de détail a permis d'isoler des Campylobacter spp. dans plus de 30% des échantillons. La plupart appartiennent à la catégorie des C. jejuni. Les méthodes de détection classiques des Campylobacter spp. exigeant énormément de temps et de travail, deux sets de tests ADN disponibles dans le commerce pour l'identification des Campylobacter dans les produits alimentaires ont été évalués quant à leur vitesse, leur spécificité et leur sensibilité. Les deux sets ont révélé une spécificité de près de 100%, bien que pour l'obtention d'un signal positif, la présence d'au moins 107 cellules de Campylobacter par ml semble nécessaire, des chiffres qui ne peuvent être obtenus qu'après un long enrichissement. L'exécution relativement rapide (45 min. à 3h) est réduite à néant par les 2 jours d'enrichissement. Une technique permettant d'abréger la période d'enrichissement semblait nécessaire. Le choix dans ce domaine s'est porté sur le fractionnement immunomagnétique (FIM), une technique par laquelle des microorganismes de l'échantillon alimentaire sont isolés et concentrés par la liaison à des anticorps spécifiques recouvrant des particules magnétiques. L'application d'un champ magnétique permet d'isoler ces particules des autres organismes ; elles sont ensuite repiquées de manière classique ou appliquées dans des techniques de détection rapide. Ce projet a utilisé les Dynabeads© M-280, activés au tosyl et recouverts de l'anticorps anti-Campylobacter disponible dans le commerce. Les tests ont révélé qu'une bonne liaison pouvait être réalisée entre les Dynabeads et l'anticorps d'une part, et entre l'anticorps et l'antigène (Campylobacter), d'autre part.
Les cultures de Campylobacter en milieu liquide avaient pour objectif prioritaire l'optimalisation de la technique de fractionnement immunomagnétique, par l'étude des principaux paramètres du processus. Le contrôle de la sensibilité et de la spécificité du système FIM dans les cultures microbiennes a permis d'obtenir un rendement atteignant 35%, tandis que dans des conditions optimales, la limite de détection atteinte est de l'ordre de 200 cellules de Campylobacter. L'utilisation du FIM dans des cultures mixtes a permis de constater une réactivité croisée et l'apparition de liaisons aspécifiques par d'autres organismes. La technique du FIM a finalement été appliquée à 90 échantillons avicoles contaminés naturellement. Ils ont été soumis à un pré-enrichissement et à un enrichissement (total : 7h) et ensuite à un fractionnement immunomagnétique parallèlement à la méthode classique de détection du Campylobacter. Après fractionnement, les beads ont été d'une part repiqués sur une série de vecteurs d'isolation sélectifs du Campylobacter spp. et d'autre part, appliqués dans une évaluation PCR spécifique. La méthode de détection classique a identifié près de 50% d'échantillons positifs. L'association FIM-repiquage n'a donné un résultat positif que pour 12% des échantillons, tandis que la combinaison FIM-PCR donnait 63% d'échantillons positifs. L'association d'une technique de concentration spécifique (FIM) et d'une méthode d'identification particulièrement sensible et spécifique (PCR) a non seulement permis de détecter un plus grand nombre d'échantillons positifs, mais les résultats ont par ailleurs été obtenus beaucoup plus rapidement. Alors que la méthode traditionnelle de détection donne un résultat encore incertain, au plus tôt, après 72 h, la combinaison FIM-PCR apporte une réponse spécifique dans un délai de 30 h, voire de 12 h, dans des conditions idéales.
Les méthodes conventionnelles employées pour la détection et l'identification des campylobacters sont longues, nécessitent énormément de travail et sont parfois même peu fiables. La réaction en chaîne polymérase ou PCR constitue une méthode de détection alternative rapide et sensible. Une première méthode a été conçue, basée sur les séquences 16S rADN. Des primers PCR universels et des probes oligonucléotides spécifiques ont été mis au point sur la base de séquences 16S rADN déjà disponibles et d'autres que nous avons déterminées. L'amplification PCR, suivie d'une hybridisation permet une détection groupe spécifique des campylobacters entéropathogènes. La séquence 16S rADN ayant des limites en ce qui concerne le développement de détection groupe-spécifique, nous sommes passés à la séquence 23S rADN.
Une méthode, basée sur la séquence 23S rADN, a été mise au point pour la détection spécifique du Campylobacter et de l'Arcobacter. A partir d'une quarantaine de séquences d'une zone variable de la séquence 23S rADN pré-déterminées, des primers spécifiques ont été conçus pour (a) la détection groupe-spécifique de campylobacters thermophiles, (b) la détection espèce-spécifique des campylobacters thermophiles, (c) la détection espèce-spécifique des campylobacters non-thermophiles, (d) la détection groupe-spécifique des arcobacters et (e) la détection espèce-spécifique des arcobacters.
Des primers PCR spécifiques pour les campylobacters thermophiles et non-thermophiles ont permis l'identification d'isolats cliniques, que d'autres analyses n'avaient pas pu identifier avec certitude.
L'évaluation PCR pour la détection groupe-spécifique des campylobacters thermophiles a été appliquée à la détection des Campylobacter spp. dans des échantillons alimentaires enrichis. 144 échantillons de poulet ont été analysés et près de 46% ont semblé positifs sur la base de l'évaluation PCR, la méthode conventionnelle donnant quant à elle 43% de résultats positifs. Dans 34% des échantillons alimentaires environ, l'évaluation PCR et les méthodes classiques ont donné des résultats contradictoires. Des recherches complémentaires ont démontré qu'ils n'étaient pas imputables à une détection de cellules de Campylobacter mortes par l'évaluation PCR ou à un écart du seuil de détection des deux méthodes.
Une méthode de détection des produits PCR alternative, la PCR ELISA a été testée. Par rapport aux méthodes conventionnelles d'analyse des produits PCR, la PCR ELISA ne présente pas une sensibilité supérieure, mais elle permet de procéder à une détection automatisée, autorisant le traitement simultané d'un grand nombre d'échantillons.
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