A2. Het ontwikkelen van snelle, specifieke en sensitieve identificatiemethoden voor Listeria monocytogenes

De klassieke bacteriologische test voor het opsporen van Listeria monocytogenes in zuivelprodukten omvat een aanrijking in vloeibaar medium (2 dagen), een groei op vaste selectieve bodem (2 dagen), gevolgd door een aantal confirmatietesten die in totaal 8 à 10 dagen in beslag nemen.

De duur voor de confirmatie van de species- en genusidentiteit kan verkort worden door het gebruik van een DNA-identificatie.

Een commerciële DNA-probe test (GenProbe, San Diego, CA) werd geëvalueerd voor de identificatie van L. monocytogenes kolonies gegroeid op de agarbodem. Alle resultaten, bekomen met de DNA-probe test werden bevestigd met de klassieke biochemische en morfologische identificatiemethode. Door middel van deze zeer elegante en niet radioactieve methode wordt L. monocytogenes geïdentificeerd op een halve dag. De totale test neemt 4,5 dagen in beslag. De 4 dagen blijven nodig voor de bacteriële aanrijking.

Om kolonies, gegroeid op de agarbodem, gelijktijdig te identificeren op genusniveau (Listeria spp.) en op species niveau (L. monocytogenes) werd een multiplex PCR-methode ontwikkeld. Voor de identificatie van Listeria spp. werden twee specifieke "primers" afgeleid van de 16S rRNA sequentie. Voor de identificatie van L. monocytogenes werden de specifieke "primers" afgeleid van de gensequentie die codeert voor het "invasion associated protein". De twee geamplifieerde DNA-fragmenten, respectievelijk 1003 bp en 593 bp, werden gescheiden d.m.v. agarose gelelektroforese. De resultaten bekomen met de multiplex PCR-methode kwamen overeen met deze bekomen met de klassieke bacteriologische methode. Deze overeenkomst werd vastgesteld voor de 64 zuivelmonsters die op basis van de selectieve uitplating vermoedelijk positief waren.

Door middel van PCR is het mogelijk, niet enkel de identificatieprocedure maar ook de aanrijking te verkorten.

Vertrekkend van een zuivere cultuur kan men tot 10 L. monocytogenes bacteriën per ml detecteren. Om de gevoeligheid van PCR voor de detectie van L. monocytogenes in kaasmonsters na te gaan werd gebruik gemaakt van een kunstmatige besmetting na aanrijkingsincubatie. De PCR werd geïnhibeerd door kaascomponenten en niet door de bestanddelen van het aanrijkingsmedium. De detectielimiet varieerde tussen 10 tot 10⁶ kolonievormende eenheden per ml, afhankelijk van de geanalyseerde zachte en halfharde kaas.

PCR kan bijgevolg slechts toegepast worden voor het verkorten van de aanrijkinsprocedure als een degelijke staalvoorbereiding wordt toegepast. Het is zelfs mogelijk om via PCR zonder bacteriële cultuur direct L. monocytogenes op te sporen in het voedingsprodukt.

Een detectiemethode voor Listeria monocytogenes in 25 ml rauwe melk werd ontwikkeld. De detectielimiet werd gesitueerd tussen 5 kolonievormende eenheden (kve) en 10 kve in 25 ml rauwe melk. De detectiemethode is gebaseerd op een chemische extractie van de melkcomponenten en een twee-staps PCR-amplificatie met twee koppels "primers" waarvan het tweede inwendig gelokaliseerd is t.o.v. het eerste. De resultaten met deze methode worden op 1 dag bekomen.

Bij het toepassen van een directe detectiemethode, stelt zich de vraag in hoeverre PCR de afgedode L. monocytogenes bacteriën detecteert. Afgedode L. monocytogenes worden door PCR gedetecteerd na behandeling met verschillende desinfectantia en bij verschillende temperaturen. De gevoeligheid van deze PCR detectie is sterk afhankelijk van de toegepaste behandeling. Oplossing van L. monocytogenes cellen in pure ethanol voor 30 dagen vermindert de PCR gevoeligheid slechts 100 maal t.o.v. niet behandelde cellen. Behandeling met 1% HCl en sterilisatie (124°C voor 15 min) verhindert PCR-detectie na 1 uur.

Omwille van de mogelijke detectie van afgedode L. monocytogenes cellen met PCR, wordt voor controle doeleinden, geopteerd voor een korte, overnacht aanrijking, gevolgd door een eenvoudige staalvoorbereiding en een PCR-identificatie. Op deze wijze wordt een 24 uur-48 uur detectietijd bekomen met een betrouwbaar resultaat.

Moleculaire typeringstechnieken laten toe een bacteriële stam te identificeren tot het subspecies niveau. Hierdoor is het mogelijk een besmettingsbron op te sporen wat van belang is bij epidemiologische studies en in de industrie.

De moleculair biologische typeringstechniek "RAPD" ("Randomly Amplified Polymorphic DNA Profile") werd uitgevoerd op 100 L. monocytogenes stammen. De RAPD-techniek is gebaseerd op een PCR met behulp van korte primers die op verschillende plaatsen in het chromosoom kunnen binden. Om de reproduceerbaarheid van deze techniek te evalueren werd deelgenomen aan de internationale WHO-ringanalyse. Uit deze studie bleek dat vooral de reproduceerbaarheid tussen laboratoria met verschillende thermocyclers en kleine variaties in PCR-bufferconcentratie een probleem stelt.

Moleculaire typering van Listeria spp. en L. monocytogenes was ook mogelijk via PCR, gebaseerd op repetitieve DNA-sequenties. Families van repetitieve DNA sequenties komen verspreid voor in het genoom van verschillende bacteriële soorten. Twee families werden aangewend, namelijk de 35 tot 40 bp repetitieve extragenische palindroom sequentie (REP) en de 124 tot 127 bp enterobacteriële repetitieve intergenische consensus sequentie (ERIC).

Door middel van REP-PCR werden stammen geïdentificeerd op een vergelijkbare manier als met serotypering en RAPD-typering. Het discriminerend vermogen van ERIC-PCR was kleiner in vergelijking met REP-PCR. Het voordeel van deze methode is zijn eenvoud, gecombineerd met een grote reproduceerbaarheid.