A3. De besmetting van voedsel door Listeria monocytogenen; Een evaluatie van de situatie en een studie van technische verbeteringen tijdens de aanmaak

Doelstellingen

• Een eventueel verband evalueren tussen de besmetting van de kaas met Listeria monocytogenes en een hygiënefout bij de aanmaak ervan.
• Een eventueel verband leggen tussen de in het voedsel, en meer bepaald in de kazen, geïsoleerde stammen en de stammen afkomstig van gevallen van humane listeriose.
• Inhiberende stammen van Listeria monocytogenes isoleren en identificeren in smetvrije kazen en in vitro inhibitietesten uitvoeren.
• Aanbevelingen formuleren in het kader van de Volksgezondheid.

Om deze doelstellingen te bereiken, werden verscheidene benaderingen overwogen:

(a) Een studie van de besmetting van kazen met Listeria. Hierbij werden 1.902 monsters bestudeerd en kon men drie methoden vergelijken om Listeria op te sporen. De doelstellingen van dit deel waren:

• de frequentie en de graad van besmetting van de kazen evalueren.
• het verband evalueren tussen de frequentie van de besmetting en het kaastype (harde/weke).
• de plaats van de besmetting evalueren.
• het verband bestuderen tussen de besmetting met Listeria spp en de graad van fecale pollutie.

De analyse van de kaasmonsters en de identificering van de stammen werden uitgevoerd op de ULB; het IHE heeft de identificering van de stammen bevestigd en heeft de serotypie uitgevoerd.

(b) Een studie voor de karakterisering van de in België geïsoleerde stammen van Listeria monocytogenes in verschillende voedingsmiddelen en in sporadische gevallen van humane listeriose. Voor dit deel moest het IHE een nieuwe typeringsmethode ontwikkelen op basis van de polymorfie van de esterasen. Hierbij werden 832 stammen bestudeerd.

Een vergelijkende analyse door serotypie en "esterase typing" werd uitgevoerd op de twee populaties van stammen (klinische en uit de voedingsmiddelen), en er werden onderscheidingsindexen berekend. Deze studie heeft aangetoond dat de uit kazen geïsoleerde populatie van Listeria monocytogenes verschilt van de uit klinische gevallen geïsoleerde populatie. Dit kon niet worden verklaard door een verschillende secretie van de virulentiemarker PI-PLC, noch door een verschillende pathogeniteit van alle stammen in een murien model. Het "esterase typing" systeem werd bovendien voor de eerste keer toegepast door het IHE om een besmet voedingsmiddel te vinden in een geval van sporadische listeriose.

De ULB heeft 54 stammen van Listeria monocytogenes, waarvan 27 humane stammen die geleverd werden door het IHE, en 27 stammen die uit kazen geïsoleerd werden, gekarakteriseerd door een studie van de polymorfieën van de hybridisatie met de sondes van ARNr 16s of 23s op restrictieprofielen met twee endonucleasen. Deze studie werd uitgevoerd dank zij de medewerking van de ULg.

(c) Een studie waarin mogelijkheden werden gezocht om de technieken te verbeteren om de besmetting te verminderen of te voorkomen. Inhiberende stammen van Listeria monocytogenes werden gezocht in smetvrije kazen. De verschillende stammen werden geïdentificeerd en een vollediger studie over de factoren die de produktie van deze stoffen met antagonistische werking beïnvloeden, en over de kenmerken van deze stoffen, werd uitgevoerd op twee stammen. De kenmerken van deze moleculen werden vergeleken met de kenmerken van nisine.

Samenvatting van de aan de ULB uitgevoerde onderzoeken

Onze studie omvatte drie delen. In het eerste deel werd de besmetting van Belgische en buitenlandse kazen met Listeria monocytogenes geëvalueerd. In het tweede deel werd geprobeerd een techniek voor karakterisering van de stammen door ribotypering aan te passen voor Listeria monocytogenes. En in het laatste deel werden bacteriële stammen gezocht die de groei van L. monocytogenes kunnen inhiberen en werden de antagonistische delen van deze stammen gekarakteriseerd.

Om de doelstellingen van het eerste deel van de studie te kunnen bereiken, hebben wij drie methoden voor de detectie van Listeria aangepast en vergeleken: de methode met rechtstreeks onderzoek, de methode met dubbele aanrijking en de methode met koude aanrijking.

De serologie en de bevestiging van de identificering van de stammen van L. monocytogenes werden uitgevoerd in het Nationaal Onderzoekscentrum voor Listeria aan het IHE (Dokter P. ANDRE). In het tweede deel hebben wij de restrictieprofielen van stammen van L. monocytogenes met de endonucleasen EcoR1 en Hindlll bestudeerd. Wij hebben op deze restrictieprofielen een ribotypering door hybridisatie met de sondes van ARNr 16S van Bacillus subtilis en van ARNr 23S van Clostridium perfringens uitgevoerd. Dit deel van het experiment werd uitgevoerd in het laboratorium voor Microbiologie van de diergeneeskundige faculteit van de Universiteit van Luik (Professor KAECKENBEECK en Dokter G. DAUBE). In het derde deel van de studie hebben wij inhiberende stammen geïsoleerd uit niet met Listeria sp besmette kazen. Daarna hebben wij de antagonistische eigenschappen onderzocht van de stammen waarvan de inhibering noch aan de produktie van zure metabolieten, noch aan de produktie van waterstofperoxide te wijten was.

In het eerste luik van de studie hebben wij voor drie verschillende perioden 1.902 kaasmonsters (1.520 Belgische en 382 ingevoerde) geanalyseerd. Listeria sp. werd geïsoleerd in 446 monsters (23,4%) en Listeria monocytogenes werd geïsoleerd in 159 monsters (8,4%). Wij hebben na verloop van tijd een daling van de graad van besmetting met L. monocytogenes vastgesteld. De besmetting daalde immers van 11% (periode van juni 1988 tot september 1990) tot 6,9% (periode van maart 1991 tot februari 1992) en uiteindelijk tot 6,4% (periode van april 1992 tot februari 1993). In de loop van het jaar 1995 werden 52 nieuwe kaasmonsters geanalyseerd. Uit deze laatste monsterneming kon onder meer worden afgeleid dat één producent nog altijd besmette kaas levert. De vaakst geïsoleerde twee types van Listeria zijn L. innocua en L. monocytogenes. Het serotype 1/2a van L. monocytogenes vertegenwoordigde 77,9% van de stammen van deze soort en het serotype 4b 12,6%.

De weke kazen zijn het meest besmet. De besmetting is voornamelijk gesitueerd in de buitenste lagen van de kaas of over de volledige kaas. Er werd bovendien een significant verband aangetoond tussen de besmetting met Listeria en de aanwezigheid van fecale coliformen. Het aantal L. monocytogenes varieerde naargelang van de monsters van minder dan 100/g tot 106/g.

Voor de typering van de stammen van Listeria vertonen de restrictieprofielen met de twee endonucleasen een te groot aantal banden om gemakkelijk te kunnen worden gebruikt. Ribotyperingen met een restrictie met het enzym EcoR1 en een hybridisatie met de sonde van ARNr 23S van C. perfringens of een restrictie met het enzym Hindlll en een hybridisatie met de sonde van ARNr 16S van B. subtilis hebben de beste scheidingen van de stammen opgeleverd, vooral dan in combinatie met serotypering. In vergelijking met het gebruik van alleen maar serotypering, hebben wij met deze techniek een relatief homogene en aanhoudende besmetting kunnen aantonen in twee kazen van dezelfde producent, terwijl een derde kaas een meer heterogene besmetting vertoonde.

Ribotypering is dus een techniek die goede diensten kan leveren voor studies van de besmetting van voedingsmiddelen.

In het derde deel hebben wij uit 1.320 geteste stammen, 25 stammen geselecteerd waarvan de inhiberende eigenschappen interessant lijken. Het zijn 22 stammen van Enterococcus faecalis, 2 stammen van Lactococcus lactis en 1 stam van Pediococcus pentosaceus. Eén stam van E. faecalis en de stam van P. pentosaceus werden geselecteerd voor de studie van de eigenschappen van hun antagonistische gedeelte. Er werden verscheidene parameters bestudeerd: voorwaarden voor de produktie van de antagonist, zijn gevoeligheid voor proteasen en voor warmte en de invloed van de pH-waarde en van de caseïne op de activiteit. Deze studies hebben aangetoond dat twee moleculen eigenschappen van bacteriocines bezitten. Net zoals nisine, zijn het bactericide en thermostabiele bacteriocines. In tegenstelling met nisine, hebben ze een relatief beperkt spectrum. De produktie van het antagonistische gedeelte door de Enterococcus hangt af van een plasmide. De pogingen om deze plasmide over te dragen op stammen van melkbacteriën hebben echter geen resultaten opgeleverd.

We raden aan de besmetting van voedingsmiddelen met Listeria monocytogenes regelmatig te controleren. In geval van kazen, moet vooral aandacht worden besteed aan weke kazen. De kazen zouden allemaal niet meer met rauwe melk, maar met gepasteuriseerde melk moeten worden gemaakt. De verbetering van de hygiëne bij de produktie moet gebaseerd zijn op de installatie van een HACCP systeem (hazard analysis critical control point) en op de studie van snelle en genormaliseerde detectiemethoden die aangepast zijn voor elk pathogeen en voor elk voedingsmiddeltype.

De kaas zou beter kunnen worden beschermd door het gebruik van zuivere bacteriocines tijdens de rijping, dan door het gebruik van de antagonistische stammen zelf. Een andere methode zou het gebruik kunnen zijn van melkbacteriën, de natuurlijke stammen van de rijping van de kaas, waarop de plasmiden voor de produktie van bacteriocines overgedragen zouden zijn.

Samenvatting van de op het IHE uitgevoerde onderzoeken

Wij hebben stammen van Listeria monocytogenes geanalyseerd die in België geïsoleerd werden in verschillende voedingsmiddelen en in sporadische gevallen van humane listeriose. De verdeling van de stammen volgens hun serovar was verschillend voor beide populaties. De stammen die afkomstig waren van kazen en de stammen uit humane listeriose werden meer gedetailleerd bestudeerd aan de hand van een typeringsmethode die in de loop van dit programma ontwikkeld werd.