Projet de recherche C3/019 (Action de recherche C3)
Contexte
Aspergillus fumigatus est un champignon saprophyte du sol très répendu, présent tant dans l’air extérieur qu’intérieur. Il est également au premier rang des champignons opportunistes dangereux pour l'homme, causant des infections invasives particulièrement chez des patients immunodéprimés et colonisant les voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose (patients CF), contribuant ainsi à la dégradation de leur fonction respiratoire.
L'espèce A. fumigatus a une pathogénicité beaucoup plus importante que les autres champignons filamenteux présent dans l'environnement, celle-ci est liée en grande partie à sa thermotolérance. C'est pourquoi de nombreux facteurs de virulence ont été étudiés, et il est actuellement bien établi que la virulence est multifactorielle. En outre, pour des raisons légales, il y a un besoin urgent de développer une méthode de typage moléculaire standardisée, analysable informatiquement et fournissant un résultat non ambigu permettant d'établir une relation entre souches de l’environnement et souches de patients.
Description du projet
Des études précédentes (réalisées par des membres du réseau) ont montré que plusieurs genotypes d’A. fumigatus sont fréquemment isolés chez un même patient, et que la diversité génétique chez ceux-ci est moins importante que celle observée dans l’environnement. Ceci suggère que même si tous les isolats sont potentiellment pathogènes dans un hôte réceptif, certaines souches pourraient être plus adaptées au développement dans le corps humain, environnement hostile pour ce champignon environnemental.
Les patients atteints d’aspergillose invasive sont souvent contaminés par différents isolats de genotypes différents. Il a aussi été montré que des isolats séquenciels (collectés à différents moments) chez des transplantés pulmonaires appartiennent à des génotypes différents; ces observations ont été confirmées chez des patients CF et récemment colonisés par A. fumigatus. Par contre des patients CF colonisés chroniques présentent un nombre moindre de genotypes, et un genotype particulier commun à ces patients a été mis en evidence, suggérant une sélection génotypique avec le vieillissement de la colonisation aspergillaire.
La collection biomédicale de champignons et de levures, BCCM/IHEM a développé au cours de ces dernières années une très importante sous-collection d'A. fumigatus d’origine humaine et environnementale. Au début du projet, 1657 isolats d’A. fumigatus étaient disponibles dans la collection, 389 déjà cités dans des publications.
Objectifs / méthodologie
En tenant compte de l’état des connaissances dans le domaine du projet, de l’expérience des partenaires, du matériel biologique et des données disponibles dans la collection BCCM/IHEM, nous avons défini les objectifs et les méthodes suivantes :
• Objectif 1
Le développement de la sous-collection d’isolats d’A. fumigatus (en accord avec les besoins des autres objectifs) et le rassemblement de l’information dans une banque de donnée unique. Le catalogue de la collection BCCM/IHEM disponible sur le site http://bccm.belspo.be/db/ est basé sur des critères communs aux catalogues des réseaux européens, mais n’est pas adapté pour des données scientifiques et médicales.
• Objectif 2
Les études publiées sur le typage d’A. fumigatus sont hétérogènes et sont souvent difficiles à transposer d’un laboratoire à un autre. Il y a un besoin urgent de définir une méthode "golden standard" pour le typage d’A. fumigatus. Parmi les techniques disponibles, la méthode “Multilocus sequence typing” (MLST) s’est distinguée, il s’agit en effet d’une méthode puissante et transposable d’un laboratoire à l’autre, développée initialement pour les bactéries et récemment mise au point pour Candida albicans. En effet, sa portabilité est due au fait qu’il s’agit d’une méthode basée sur le séquençage. L’objectif du projet initial était de mettre au point le schéma de typage par MLST pour A. fumigatus. Cependant, suite aux retards dans le démarrage du projet, cette étude a été lancée par d’autres équipes, en particulier par le Dr. Frank Odds (Professeur de Mycologie Médicale à l’Institut des Sciences médicales d’Aberdeen). Une collaboration a été demandée a cette équipe afin que le typage des souches de la sous-collection puisse être réalisé plus rapidement. Sept genes ont été sélectionnés par cette équipe (ANX4, BGT1, CAT1, LIP, MAT1-2, SODB and ZRF2) ainsi que des primers pour le séquençage. Cette méthode sera appliquée à des souches pour lesquelles des données de typage sont disponibles pour d’autres méthodes. Le partenaire 2 va implémenter la MLST et screener la sous-collection.
• Objectif 3
Cet objectif se focalise sur l’identification de facteurs de virulence chez les souches présentant des génotypes dominants. Une comparaison sera réalisée entre différents génotypes identifiés dans l’environnement et des souches cliniques de patients CF ou de transplantés pulmonaires. Dans ce but, une approche protéomique sera développée en utilisant la technique SELDI-TOF (surface enhaced laser desorption/ionisation), différents “chips arrays” seront sélectionnés (hydrophiles, hydrophobes, et à affinités pour les métaux). Les profils seront analysés par le système de Ciphergen. L’électrophorèse à deux dimensions permettra dans une étape ultérieure la caractérisation des biomarqueurs intéressants.
Une autre approche sera l’étude des propriétés phénotypiques impliquées dans la virulence, comme la capacité d’adhérence des conidies. L’expression à la surface des conidies de récepteurs fongiques sera investigée par cytométrie en flux, et des propriétés physiques telles que les charges électrostatiques et l’hydrophobicité de surface seront étudiées par microélectrophorèse et separation en deux phases.
Résultats/produits
Une méthode standardisée de typage reproductible par MLST sera comparée aux autres outils disponibles et aidera à comprendre l’épidémiologie des colonisations chez des patients atteints de mucoviscidose et chez des patients atteints d’infections profondes. L’hypothèse d’une sélection génotypique sera vérifiée ainsi que les capacités d’adhérence des conidies. Ces données pourraient être d’une aide diagnostic précieuse et aider à une décision thérapeutique face à la colonisation par A. fumigatus chez des patients mucoviscidose.
Le SELDI permettra de caractériser pour la première fois des biomarqueurs fongiques utiles pour le diagnostic.
La collection BCCM/IHEM développera un service de fourniture de DNA et d’extraits protéiques réalisés en conditions parfaitement satndardisées.
Interactions entre les différents partenaires
Institut Scientifique de Santé Publique – Section Mycologie (Laboratoire Hôte de la collection BCCM/IHEM)
Coordination du projet. Préservation des isolats, préparation de DNA et d’extraits protéiques standardisés. Electrophorèse à 2 dimensions.
Laboratoire de Microbiologie Pharmaceutique – Université de Gand
Typage par MLST
Laboratoire de Parasitologie Mycologie Médicale & Centre d’Investigation Clinique (Grenoble, France)
Analyse SELDI, électrophorèse à 2 dimensions
Laboratoire de Parasitologie Mycologie - Groupe d'Etude et d'Interaction Hôte Parasite( GEIHP) (Angers, France).
Capacités d’adhérence des conidies
Partenaires
Institut Scientifique de Santé Publique
Rue Juliette Wytsman 14
B-1050 Bruxelles
Tel + 32 2 642 56 30
Fax +32 2 642 55 19
Dr. Françoise Symoens (f.symoens@iph.fgov.be)
Université de Gand
Laboratoire de Microbiologie Pharmaceutique – Université de Gand
Harelbekestraat 72
B-9000 Gent
Tel + 32 9 264 80 91
Fax + 32 9 264 81 95
Dr. Tom Coenye (Tom.Coenye@UGent), Dr. Hans Nelis (Hans.Nelis@Ugent.be)
Laboratoire de Parasitologie Mycologie Médicale & Centre d’Investigation Clinique
CHU A Michallon, BP 217 F-38043 Grenoble, France
Tel + 33 4 76 76 54 90
Fax + 33 4 76 76 56 60
Dr. Claudine Pinel (CPinel@chu-grenoble.fr), Dr. Renée Grillot (RGrillot@chu-grenoble.fr)
Host Parasite Interaction Study Group (Groupe d’Etude des Interactions Hôte-Parasite)
Laboratoire de Parasitologie-Mycologie
4, rue Larrey F-49033 Angers Cedex 01, France
Tel+ 33 2 41 35 34 72
Fax + 33 2 41 35 36 16
Dr. Jean-Philippe Bouchara (Jean-Philippe.Bouchara@univ-angers.fr)
Users Committee
Dr. Lucien Noens, Département d’Hématologie et Banque de sang – Hôpital Universitaire de Gand
Dr. Bart Gordt, Hôpital St-Jean – Bruges
Dr. Renaat Peleman – Médecin chef, Hôpital Universitaire de Gand - Unité d’Enseignement et de Recherche – Maladies internes.
Prof. Danielle Swinne, BCCM/IHEM Collection – Institut Scientifique de Santé Publique
