Projet de recherche C3/020 (Action de recherche C3)
1. Contexte
Ces dernières années, l'interférence ARN (RNAi) est devenue la méthode par excellence pour les analyses de "génétique inverse" chez les espèces animales et végétales. Dans le cadre du programme européen AGRIKOLA, nous avons ainsi pu constituer une bibliothèque à l'échelle du génome, qui regroupe des séquences et des constructions pour l'inactivation ou « silencing » post-transcriptionnel RNAi de la plupart des gènes de la plante modèle Arabidopsis thaliana. Cette technique repose sur la manipulation de fragments d'ADN génomique via le système de clonage par recombinaison Gateway. Tout d'abord, des "marqueurs" de 150 à 500 pb spécifiques aux gènes (gene specific tags-GST) sont introduits dans les "clones d'entrée" par le biais d'une réaction clonase BP in vitro. Ensuite, les GST sont transférés vers les vecteurs conçus pour l'expression des ARN "en épingle à cheveux" dans les cellules de plantes transgéniques via une double réaction clonase LR in vitro. Le consortium AGRIKOLA a déjà généré plus de 23 000 constructions « silencing », dont chacune intervient dans le knockdown d'une transcription différente. La recherche préliminaire sur la diffusion et la fréquence des phénotypes observés dans les lignées Arabidopsis, qui subissent une transformation en présence de telles constructions, montre qu'il s'agit d'une précieuse "ressource". (Hilson et al., 2004, Genome Research 14, 2176).
2. Description du projet
2.1. Objectifs
Malheureusement, le financement actuel dans le cadre du projet AGRIKOLA en cours ne permet pas de valider les constructions obtenues : leur identité n'est pas confirmée par les données de séquençage et il est impossible de cloner les souches bactériennes qui les portent. Ce projet de collaboration entre la division "Génomique fonctionnelle" du département de phytobiologie (Université de Gand) et la collection de plasmides de BCCM/LMBP constituée au sein de l'unité d'enseignement et de recherche de biologie moléculaire (Université de Gand) a pour but de combler ces lacunes. Notre objectif est d'améliorer la qualité des ressources d'AGRIKOLA, d'assurer la conservation des plasmides et des souches bactériennes sur le long terme et de les diffuser au sein d'une vaste communauté scientifique en respectant les normes strictes appliquées par les Centres de Ressources Biologiques. Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons attester l'authenticité d'un répertoire de plasmides, conçu pour le silencing RNAi de 2 500 gènes d'Arabidopsis.
2.2. Méthodologie(s)
Le travail proposé peut être résumé en 4 étapes successives : (1) les "clones d'entrée" qui portent les GST correspondant aux gènes sélectionnés, seront extraits du mélange des stocks bactériens d'AGRIKOLA. (2) Leur identité sera établie par la validation du séquençage et des clones différents seront isolés à plusieurs reprises jusqu'à ce que les bons aient été identifiés. (3) Après le transfert des GST validés vers un vecteur d'expression ARN "en épingle à cheveux" (cette étape n'est pas reprise dans ce projet), l'intégrité de ces constructions sera certifiée à l'aide d'une analyse de modèle d'enzyme de restriction. (4) Tous les plasmides identifiés comme authentiques et les souches Escherichia coli correspondantes seront classés dans la collection publique de LMBP selon leurs protocoles normatifs, parallèlement aux données afférentes qui seront intégrées au réseau bioinformatique de BCCM. De cette manière, la conservation à long terme des "ressources" sera garantie, tout comme leur distribution à des tiers.
2.3. Interaction entre les différents partenaires
Le travail proposé sera le fruit d'une collaboration étroite et continue entre PSB et LMBP, et sera d'autant plus facile dans la mesure où les deux partenaires travaillent dans le même bâtiment.
2.4. Réalisation et/ou résultats attendus
Matériel biologique
- 2 500 "clones d'entrée" Gateway purs (ADN plasmide et souche E. coli), chacun authentifié à l'aide de l'analyse de séquençage du GST cloné ;
- 2 500 vecteurs d'expression ARN "en épingle à cheveux" purs (ADN plasmide et souche E. coli), dont l'intégrité a été établie à l'aide d'une analyse de modèle d'enzyme de restriction.
Tous les plasmides et toutes les souches seront stockés en double exemplaire par BCCM/LMBP et seront disponibles publiquement.
Informations relatives aux plasmides
Toutes les informations pertinentes relatives aux plasmides authentifiés seront incorporées à la banque de données BCCM/LMBP et seront disponibles en ligne sous un format standardisé. En outre, l'interface Web de la banque de données BCCM/LMBP prévoira des possibilités de recherche permettant de retrouver des clones spécifiques sur la base du nom et de l'annotation fonctionnelle du gène correspondant au GST.
La collection de plasmides hautement qualitative qui sera générée au cours de ce projet, constituera un complément substantiel pour LMBP. Pour la première fois, elle introduira le matériel phytobiologique dans BCCM. Cela suscitera probablement un large intérêt au niveau international et promouvra la recherche sur Arabidopsis dans le monde entier.
3. Partenaires
Activités
PSB : "génomique" fonctionnelle dans les plantes, banques de séquençage, "screens" d'interférence ARN "à l'échelle du génome", titrages basés sur la cellule, construction de vecteurs.
LMBP : conservation et répartition du matériel biologique, plus particulièrement les plasmides, et informations associées.
4. Comité d'utilisateurs
Dr. Robert Ackerson Devgen
Prof. Geert Angenon VUB
Dr. Henri Batoko UCL
Prof. Bruno Cammue KUL
Dr. Sean May Nottingham Arabidopsis Stock Center
Dr. Michael Metzlaff Bayer CropScience
Prof. Claire Périlleux ULg
Prof. Dr. Harry Van Onckelen UA
Prof. Nathalie Verbruggen ULB
