A2. Mise au point de méthodes d'identification rapides, spécifiques et sensibles de Listeria monocytogenes

Le test bactériologique classique pour la détection des Listeria monocytogenes dans les produits laitiers comporte un enrichissement en milieu liquide (2 jours), une culture sur un support sélectif (2 jours), suivis d'une série de tests de confirmation s'étalant au total sur une période de 8 à 10 jours.

Le temps de confirmation de l'identité des espèces et des gènes peut être abrégé en recourant à l'identification ADN.

Un test ADN commercial (GenProbe, San Diego, CA) a été évalué pour l'identification de colonies de L. monocytogenes cultivées sur gélose. Tous les résultats obtenus par le test ADN ont été confirmés par les méthodes d'identification biochimiques et morphologiques traditionnelles. Grâce à cette méthode très élégante et non radioactive, les L. monocytogenes sont identifiés en une demi-journée. L'ensemble du test dure 4,5 jours. Les 4 jours demeurent indispensables pour l'enrichissement bactérien.

Une méthode PCR multiplex a été mise au point pour l'identification simultanée des genres (Listeria spp.) et des espèces (L. monocytogenes) des colonies cultivées sur gélose. Deux "primers" spécifiques ont été dérivés de la séquence 16S rARN pour l'identification des Listeria spp. Pour l'identification des L. monocytogenes, les "primers" spécifiques sont dérivés de la séquence génétique qui codifie l'"invasion associated protein". Les deux fragments d'ADN amplifiés, respectivement 1003 bp et 593 bp, ont été séparés par élecrophorèse sur gel d'agarose. Les résultats obtenus par la méthode PCR multiplex correspondaient à ceux obtenus par la méthode bactériologique classique. Cette concordance a été observée pour 64 échantillons de produits laitiers, soupçonnés d'être positifs, sur la base du repiquage sélectif.

La PCR permet d'abréger la procédure d'identification, ainsi que la période d'enrichissement.

Partant d'une culture pure, il est possible de détecter jusqu'à 10 bactéries L. monocytogenes par ml. Une contamination artificielle après incubation d'enrichissement a été effectuée pour tester la sensibilité de la PCR en matière de détection des L. monocytogenes dans les échantillons de fromage. La PCR a été inhibée par des composants du fromage et non pas par des composants de l'instrument d'enrichissement. La limite de détection a oscillé entre 10 et 10⁶ ufc par ml, selon que l'analyse porte sur des fromages à pâte molle ou semi-dure.

La PCR ne peut dès lors être utilisée que pour raccourcir la procédure d'enrichissement, lorsque l'échantillon a été correctement préparé. Les L. monocytogenes peuvent même être directement détectés dans le produit alimentaire, par PCR, sans culture bactérienne. Une technique de détection des Listeria monocytogenes dans 25 ml de lait cru a été mise au point. La limite de détection a été estimée entre 5 et 10 ufc dans 25 ml de lait cru. La méthode de détection s'appuie sur une extraction chimique des composantes du lait et une amplification PCR en deux étapes, à l'aide de deux couples de "primers" dont le second est localisé au niveau interne, par rapport au premier. Cette méthode fournit des résultats en 1 jour.

Lors de l'application d'une méthode de détection directe, il est permis de s'interroger sur la capacité de la PCR à détecter les bactéries L. monocytogenes détruites. Les L. monocytogenes détruites ont été détectées par PCR, après traitement avec plusieurs désinfectants et à des températures différentes. La sensibilité de la détection par PCR dépend énormément du traitement appliqué. La dilution de cellules de L. monocytogenes dans de l'éthanol pur pendant 30 jours ne réduit la sensibilité de la PCR que de 100 fois par rapport aux cellules non traitées. Un traitement à l'aide d' 1% d'HCl et une stérilisation (124°C pendant 15 min.) empêchent toute détection par PCR après 1 heure.

Pour permettre la détection des cellules de L. monocytogenes mortes par PCR, il a été opté, pour le contrôle, en faveur d'un enrichissement d'une nuit, suivi d'une préparation simple de l'échantillon et d'une identification par PCR. Une durée d'identification de 24 à 48 heures, donnant des résultats fiables, est ainsi obtenue.

Les techniques de typage moléculaire permettent d'identifier une souche bactérienne jusqu'au niveau des sous-espèces. Il est ainsi possible de rechercher une source de contamination, élément important pour les études épidémiologiques et pour l'industrie.

La technique biologique de typage moléculaire "RAPD" ("Randomly Amplified Polymorphic DNA Profile") a été appliquée à 100 souches de L. monocytogenes. La technique RAPD s'appuie sur une PCR, à l'aide de primers arbitrairement choisis. Pour évaluer les possibilités de reproduction de cette technique, nous avons participé à l'analyse de l'OMS. Il ressort de cette étude que les laboratoires utilisant plusieurs thermocyclers et de faibles variations des concentrations tampons PCR obtiennent les plus faibles reproductibilités de résultats.

Le typage moléculaire des Listeria spp. et des L. monocytogenes a également pu être réalisé grâce à la PCR, basée sur des séquences répétitives d'ADN. Des familles de séquences répétitives d'ADN apparaissent dans le génome de plusieurs espèces bactériennes. Deux familles ont été utilisées, soit la séquence 35 à 40bp répétitive extragénique palindromique (REP) et la séquence 124 à 127 bp "enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence" (ERIC).

La REP-PCR a permis d'identifier des souches de manière comparable au typage sérique et au typage RAPD. Comparée au REP-PCR, la capacité discriminatoire d'ERIC-PCR était inférieure. L'avantage de cette méthode réside dans sa simplicité, associée à une meilleure reproductibilité.