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Dr. Devleeschouwer, ULB - Biocontaminants et Microbiologie et Hygiène, Inst. de Pharmacie - CP 205/2,
Boulevard du Triomphe, 1050 Bruxelles
Prof J. Dony, ULB - Unité des Biocontaminants et risques physico-chimiques du milieu
Boulevard du Triomphe, 1050 Bruxelles
Pour atteindre ces objectifs, diverses approches ont été envisagées :
(a) Une étude de la contamination de fromages par Listeria. Cette étude porte sur 1902 échantillons et a permis de comparer trois méthodes de détection de Listeria. Les objectifs de cette partie étaient :
L'analyse des échantillons de fromages ainsi que l'identification des souches ont été réalisées par l'ULB, l'IHE a confirmé les identifications des souches et procédé à la sérotypie.
(b) Une étude de caractérisation des souches de Listeria monocytogenes isolées en Belgique de différents aliments et de cas sporadiques de listériose humaine. Cette partie a nécessité le développement par l'IHE, d'une nouvelle méthode de typage sur base de polymorphisme des estérases. Cette étude porte sur 832 souches.
Une analyse comparée par sérotypie et "esterase typing" a été effectuée sur les deux populations de souches (cliniques et alimentaires), et des indices de discrimination ont été calculés. L'étude a montré que la population de Listeria monocytogenes isolée de fromages est différente de celle isolée de cas cliniques. Ceci n'a pu être expliqué par des différences de secrétion du marqueur de virulence PI-PLC ni par des différences de pathogénicité de l'ensemble de ces souches dans un modèle murin Le système de typage "esterase typing" a en outre été appliqué pour la première fois par l'IHE pour incriminer un aliment contaminé dans un cas de listériose sporadique.
Par ailleurs, l'ULB a caractérisé 54 souches de Listeria monocytogenes, 27 souches humaines fournies par l'IHE et 27 souches isolées de fromages par une étude des polymorphismes d'hybridation avec des sondes d'ARNr 16s ou 23s sur profils de restriction réalisés avec deux endonucléases. Cette étude a été réalisée grâce à la collaboration de l'ULg.
(c) Une étude visant à rechercher des possibilités d'améliorations techniques visant à réduire ou éliminer la contamination. Des souches inhibitrices de Listeria monocytogenes ont été recherchées dans des fromages indemnes de contamination. Les différentes souches ont été identifiées et une étude plus complète portant sur les facteurs influençant la production de ces substances à action antagoniste et les caractéristiques de celles-ci a été menée sur deux souches. Des caractéristiques de ces molécules ont été comparée à celles de nisine.
Notre étude se divise en trois parties. La première consiste en l'évaluation de la contamination par des Listeria monocytogenes de fromages belges et étrangers. La deuxième partie vise à adapter aux Listeria monocytogenes une technique de caractérisation des souches par ribotypage. La dernière partie du travail est consacrée à la recherche de souches bactériennes capables d'inhiber la croissance de L. monocytogenes et à la caractérisation des fractions antagonistes élaborées par ces souches.
Pour atteindre les objectifs de la première partie de l'étude, nous avons adapté et comparé trois méthodes de détection des Listeria : la méthode de recherche directe, la méthode par double enrichissement et la méthode par enrichissement à froid. La sérologie et la confirmation de l'identification des souches de L. monocytogenes ont été faites au Centre National de référence des Listeria à l'Institut d'Hygiène et d'Epidémiologie (Docteur P. ANDRE). Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons étudié les profils de restriction de souches de L. monocytogenes avec les endonucléases EcoR1 et HindIII. Sur ces profils de restriction nous avons fait un ribotypage par hybridation avec les sondes de l'ARNr 16S de Bacillus subtilis et de l'ARNr 23S de Clostridium perfringens.
Cette partie de l'expérimentation a été faite au laboratoire de Microbiologie de la faculté de Médecine vétérinaire de l'Université de Liège (Professeur KAECKENBEECK et Docteur G. DAUBE). Dans la troisième partie de notre travail nous avons isolé des souches inhibitrices à partir de fromages indemnes de contamination par des Listeria sp. Nous avons ensuite étudié les propriétés antagonistes de souches dont l'inhibition n'était due, ni à la production de métabolites acides, ni à la production d'eau oxygénée.
Dans le premier volet du travail nous avons analysé, en trois périodes de temps distinctes, 1902 échantillons de fromages (1520 belges et 382 importés). Des Listeria sp. ont été isolées dans 446 échantillons (23,4%) et Listeria monocytogenes a été isolé dans 159 échantillons (8,4%). Nous avons enregistré une diminution du taux de contamination par L. monocytogenes au cours du temps. En effet cette contamination passe de 11% (période juin 1988 à septembre 1990) à 6,9% (période mars 1991, février 1992) et enfin à 6,4% (avril 1992, février 1993). Au cours de l'année 1995, 52 nouveaux échantillons de fromage ont été analysés. Ce dernier échantillonnage suggère entre autres que la contamination persiste chez un producteur. Les deux espèces de Listeria les plus fréquemment isolées sont L. innocua et L. monocytogenes. Le sérotype 1/2a de L. monocytogenes représente 77,9% des souches de cette espèce, le sérotype 4b 12,6%.
Les fromages à pâte molle sont les plus contaminés. La contamination se situe principalement dans la partie superficielle du fromage ou dans la totalité de celui-ci. Enfin, une relation significative a pu être établie entre la contamination par Listeria et la présence de coliformes fécaux. Le nombre de L. monocytogenes était variable selon les échantillons, allant de moins de 100/g à 10
Pour le typage des souches de Listeria, les profils de restriction obtenus avec les deux endonucléases présentent un trop grand nombre de bandes pour être utilisés facilement. Par contre, les ribotypages, associant une restriction avec l'enzyme EcoR1 et une hybridation avec la sonde de l'ARNr 23S de C. perfringens ou une restriction avec l'enzyme HindIII et une hybridation avec la sonde de l'ARNr 16S de B. subtilis, ont donné les meilleures discriminations des souches particulièrement en association avec le sérotypage. Par rapport au sérotypage seul, cette technique nous a permis de montrer une contamination relativement homogène et persistante dans deux fromages fabriqués par le même producteur, alors qu'un troisième montrait une contamination plus hétérogène. Le ribotypage est donc une technique utile dans les études de contamination de denrées alimentaires.
Dans la troisième partie du travail, nous avons retenu, sur 1320 souches testées, 25 souches dont les propriétés inhibitrices semblaient intéressantes. Il s'agit de 22 souches d'Enterococcus faecalis, 2 souches de Lactococcus lactis et une souche de Pediococcus pentosaceus. Une souche d'E. faecalis et la souche de P. pentosaceus ont été choisies pour l'étude des propriétés de leur fraction antagoniste. Divers paramètres ont été étudiés : conditions de production de l'antagoniste, sa sensibilité aux protéases, à la chaleur et influence du pH et de la caséine sur l'activité. Ces études ont montré qu'il s'agissait de deux molécules possédant des propriétés de bactériocines. Ce sont, comme la nisine, des bactériocines bactéricides et thermostables. Elles ont, à l'opposé de la nisine, un spectre relativement étroit. La production de la fraction antagoniste par l'entérocoque est sous la dépendance d'un plasmide. Des essais de transfert de ce plasmide à des souches de bactéries lactiques n'ont toutefois pas abouti.
Nous recommandons un contrôle régulier de la contamination des aliments par Listeria monocytogenes. Dans le cas des fromages, un effort particulier devrait porter sur les fromages à pâte molle. Les fromages ne devraient plus être faits avec du lait cru mais devraient tous être faits avec du lait pasteurisé. L'amélioration de l'hygiène de fabrication passe par l'instauration du système HACCP (hazard analysis critical control point), ainsi que par l'étude de méthodes de détection rapides et normalisées, méthodes adaptées à chaque pathogène et à chaque type d'aliment.
La protection du fromage pourrait être assurée par l'utilisation de bactériocines pures introduites lors de la maturation, plus que par l'utilisation des souches antagonistes elles-mêmes. Une autre voie pourrait être l'utilisation des bactéries lactiques, souches naturelles de maturation du fromage, dans lesquelles les plasmides permettant la production des bactériocines auraient été transférés.
Nous avons analysé des souches de Listeria monocytogenes isolées, en Belgique, de différents aliments et de cas sporadiques de listériose humaine. La distribution des souches selon leur sérovar était différente dans chacune de ces populations. Les souches provenant de fromages et celles provenant de cas de listériose humaine ont été étudiées plus en détail à l'aide d'une méthode de typage développée au cours de ce programme. Nous avons analysé les estérases de L. monocytogenes par électrophorese en gel d'amidon. Cinq estérases, numérotées de EST 1 à EST 5, par ordre décroissant de migration vers l'anode, ont été identifiées. EST 1, EST 3, EST 4 et EST 5 sont particulierement actives envers l'a-naphtyl propionate tandis que EST 2 hydrolyse pri ncipalem ent l'a-naphtyl acétate. Des études d' in hibition suggerent que ces cinq estérases sont des carboxylestérases (EC 3.1.1. 1), si ce n'est que EST 1 et EST 3 sont également légerement inhibées par le parahydroxymercuribenzoate. Chacune de ces estérases possede un poiymorphisme électrophorétique. Celui-ci a été utilisé pour développer une nouveile méthode de typage (esterase typing). 20 profils électrophorétiques d~estérases ont été définis au sein des populations de souches provenant de fromages et de cas sporadiques de listériose humaine. Les souches représentées par ces 20 types ne sont pas réparties uniformément dans ces deux populations. Cette divergence dans la répartition des souches n'a pas pu etre expliquée par des différences de sécrétion du marqueur de virulence phosphatidylinositol-specific phospholipase C, ni par le niveau de pathogénicité de ces souches chez des souris immunodéprimées. L'indice de discrimination du typage sur base du polymorphisme des estérases (Dl = 0,868) a été comparé à celui du sérotypage (Dl = 0,666) et à celui obtenu par la combinaison de ces deux méthodes (Dl = 0.8991).
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